北京低* 快速提取全血RNA

【資料簡(jiǎn)介】

北京低*  快速提取全血RNA

 操作步驟：

*次使用前請(qǐng)先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入量無水乙 醇!
使用前將10X紅細(xì)胞裂解液RLB用DEPC處理水稀釋到1X.
操作前在裂解液RLT中加入β-巰基乙醇至終濃度1%,如1 ml RLT 中加入10μl β-巰基乙醇.此裂解液現(xiàn)用現(xiàn)配.配好的RLT 4℃可放置一個(gè)月.
1. 在適合大小的RNase free離心管中加入1體積（<1.5 ml）加入各種抗凝劑新鮮血液 （顛倒混勻后）和3體積的紅細(xì)胞裂解液RLB,顛倒混勻,可輕彈管壁,確保混勻.
2. 室溫放置10分鐘（期間應(yīng)該顛倒輕彈混勻數(shù)次幫助裂解紅細(xì)胞）.
如果RNA降解嚴(yán)重,可在冰上裂解,但是時(shí)間可長(zhǎng)一些以充分裂解.
3. 12,000 rpm離心20秒,倒棄紅色上清,并小心的盡可能多的吸棄上清（注意不要吸到管底的細(xì)胞團(tuán)）,留下完整的管底白細(xì)胞團(tuán).
離心后在管底應(yīng)該見到白色的白細(xì)胞團(tuán),也可能有一些紅細(xì)胞殘片和白細(xì)胞團(tuán)在一起,但是如果看到的是大部分的紅色細(xì)胞團(tuán),說明紅細(xì)胞裂解很不充分,應(yīng)該再加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞團(tuán)后重復(fù)步驟2,3.
上清盡可能的吸棄,殘留過多會(huì)稀釋裂解液,造成裂解結(jié)合異常,產(chǎn)量純度降低.
4. 渦旋或者輕彈管壁將白細(xì)胞沉淀*松散重懸,加入350μl（<0.5 ml全血）或者600μl（0.5-1.5ml全血）裂解液RLT,吹打混勻后用手劇烈振蕩20秒,充分裂解.病人血樣中白細(xì)胞數(shù)量可能大幅增加,應(yīng)該適當(dāng)減少處理量.或者按照350μl（<2x106白細(xì)胞）或者600μl（2x106-1x107白細(xì)胞）比例加RTL.
5. 用帶鈍針頭的一次性 1 ml（配0.9mm針頭） 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到滿意勻漿結(jié)果（或者電動(dòng)勻漿30秒）,可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產(chǎn)量.
6. 較估計(jì)裂解物體積,加入等體積的70%乙醇（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!）,此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心.
7. 立刻將混合物（每次小于700μl,多可以分兩次加入）加入一個(gè)吸附柱RA中,（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心60秒,棄掉廢液.
8. 加700μl 去蛋白液RW1,室溫放置30秒,12,000rpm 離心30秒,棄掉廢液.
如果DNA殘留明顯,可在加入RW1后室溫放置5分鐘再離心.
9. 加入500μl漂洗液RW（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!）,12,000 rpm 離心30秒,棄掉廢液.加入500μl漂洗液RW,重復(fù)一遍.
10. 將吸附柱RA放回空收集管中,13,000 rpm離心2分鐘,盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng).
11. 取出吸附柱RA,放入一個(gè)RNase free離心管中,根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-80℃水浴中加熱效果更好）, 室溫放置1分鐘,12,000 rpm 離心1分鐘.
12. 如果提取全血>0.5 ml或者>2x106白細(xì)胞,加30-50μl RNase free water重復(fù)步驟11,合并兩次洗脫液,或者使用*次的洗脫液加回到吸附柱重復(fù)步驟一遍（如果需要RNA濃度高）.
洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高,分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產(chǎn)量比前者高15–30%,但是濃度要低,用戶根據(jù)需要選擇.

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