技術(shù)講解：siRNA轉(zhuǎn)染詳細(xì)步驟

【資料簡介】

 A.siRNA轉(zhuǎn)染的方法

哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染的常見方法有：磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、機(jī)械法（例如,顯微注射和基因槍）、陽離子脂質(zhì)體試劑，其中陽離子脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染法是目前zui常用的轉(zhuǎn)染方法。

應(yīng)用脂質(zhì)體型轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染需要注重的幾個(gè)方面：

1. 轉(zhuǎn)染試劑的用量

2. siRNA的用量

3. 轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度

4. 轉(zhuǎn)染時(shí)的操作順序

5. 細(xì)胞與轉(zhuǎn)染試劑/siRNA復(fù)合物的溫浴的時(shí)間

B. SiMi Transfection Reagents 轉(zhuǎn)染試劑

選擇的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染條件，往往取決于不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型和不同的核酸分子。SiMi Transfection Reagents適用于核酸的體內(nèi)和體外操作，可應(yīng)用于DNA、RNA、反義寡核苷酸、siRNA的轉(zhuǎn)染，也可應(yīng)用于DNA/siRNA的共轉(zhuǎn)染操作;是一種新型的siRNA轉(zhuǎn)染試劑。

SiMi Transfection Reagents的應(yīng)用領(lǐng)域：

1. 原代培養(yǎng)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞株的基因轉(zhuǎn)染

2. siRNA高通量轉(zhuǎn)染試驗(yàn)

3. DNA轉(zhuǎn)染;DNA和siRNA的共轉(zhuǎn)染

4. 核酸（siRNA、DNA、RNA）的體內(nèi)導(dǎo)入試驗(yàn)

5. 貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染

SiMi Transfection Reagents 的特點(diǎn)：

1. 不必更換培養(yǎng)基，操作簡便易行，可在半小時(shí)內(nèi)完成操作

2. 在含血清培養(yǎng)基中也能表現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率

3. 細(xì)胞毒性低;適用細(xì)胞廣泛

4. 即用型試劑，可在含有抗生素的*培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染

5. 基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染試劑，確保沒有RNAse活性

6. 可介導(dǎo)siRNA高轉(zhuǎn)染細(xì)胞及體內(nèi)siRNA的導(dǎo)入

C.SiMi Transfection Reagents適用的細(xì)胞類型

SiMi Transfection Reagents轉(zhuǎn)染試劑可廣泛應(yīng)用于多種細(xì)胞系的DNA和siRNA轉(zhuǎn)染如：HeLa（人頸部癌細(xì)胞）、MCF-7（人乳房癌細(xì)胞）、Hep3B（人肝細(xì)胞癌細(xì)胞）、COS-7（猴腎細(xì)胞）、Neuro-2a（鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）、NIKS（人角質(zhì)化細(xì)胞）、B16（鼠黑素瘤細(xì)胞）、DLD-1（人結(jié)腸癌細(xì)胞）、NIH/3T3（鼠胚胎成纖維細(xì)胞）、HT-29（人結(jié)腸腺癌細(xì)胞）、A549（人肺癌細(xì)胞）、CHO-k1（倉鼠卵巢細(xì)胞）和293（腺病毒5 DNA轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞）,SVRbag4細(xì)胞等。

D.轉(zhuǎn)染前細(xì)胞培養(yǎng)

在細(xì)胞板上培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，應(yīng)使細(xì)胞匯合在24小時(shí)內(nèi)達(dá)到70-90%。

細(xì)胞培養(yǎng)用品	表面積（mm2/孔）	細(xì)胞密度	培養(yǎng)基（μL /孔）
96孔板	50	1.5´104-5.0´104	100μL
48孔板	100	3.0´104-1.0´105	200μL
24孔板	200	8.0´104-2.0´105	500μL
12孔板	401	1.6´105-4.0´105	1.0 mL
6孔板	962	3.0´105-8.0´105	2.0 mL
35 mm	962	3.0´105-8.0´105	2.0 mL
60 mm	2827	1.0´106-2.5´106	6.0 mL

E. 合適的SiMi Transfection Reagents用量

合適的siRNA（DNA）：lipofetamin2000比例對核酸的轉(zhuǎn)染有重要影響;我們的DNA：lipofetamin2000為1：0.5—1：5（ug:ul），siRNA：SiMi Transfection Reagents為1：0.01-1：0.1（pmol：ul）一般情況下，此范圍內(nèi)都可獲得高的轉(zhuǎn)染效率。

細(xì)胞培養(yǎng)用品	siRNA/DNA	培養(yǎng)基zui終體積	SiMi Transfection Reagents（siRNA/DNA）
96孔板	5pmol/0.2μg	100μL	0.25μl/0.5μl
24孔板	20pmol/0.8μg	500μL	1μl /2μl
12孔板	40 pmol /1.6μg	1 mL	2μl /4μl
6孔板	100 pmol /4.0μg	2 mL	5μl /10μl
35 mm	100 pmol /4.0μg	2 mL	5μl /10μl
60 mm	600 pmol /8.0μg	5 mL	10μl /20μl

F.貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序

選用生理狀態(tài)良好的細(xì)胞對提高轉(zhuǎn)染效率很重要。siRNA（DNA）和SiMi Transfection Reagents的用量和兩者的比例可在范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)整。

1. 轉(zhuǎn)染前一天，4-5?104細(xì)胞接種在24孔板上， 0.5mL含F(xiàn)BS和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培養(yǎng)基）細(xì)胞培養(yǎng)基。

2. 選擇用于初期接種的細(xì)胞數(shù)量，應(yīng)能在24小時(shí)內(nèi)使細(xì)胞匯合達(dá)到70-90%。

3. 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他無血清培養(yǎng)基）無血清培養(yǎng)基加入20pmol siRNA（或0.8μg DNA），柔和混勻;

4. 混勻SiMi Transfection Reagents試劑，用50μl無血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無血清培養(yǎng)基）稀釋1μl SiMi Transfection Reagents試劑（DNA轉(zhuǎn)染時(shí)，則加入2μlSiMi Transfection Reagents試劑），輕輕混勻，室溫放置5分鐘;

5. 將稀釋好的siRNA和SiMi Transfection Reagents試劑混合;輕柔混勻，室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/SiMi Transfection Reagents（或DNA/SiMi Transfection Reagents）復(fù)合物。

6. 將100μl siRNA/SiMi Transfection Reagents（或DNA/SiMi Transfection Reagents）復(fù)合物加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中，來回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板板。

7. 細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育24h-48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它檢測步驟。如果細(xì)胞株比較敏感，孵育4-6小時(shí)后，除去復(fù)合物，更換培養(yǎng)基。

G.懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序

1. 轉(zhuǎn)染的當(dāng)天，收集細(xì)胞離心，用含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基重懸。

2. 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他無血清培養(yǎng)基）無血清的培養(yǎng)基加入20pmol siRNA（或0.8μg DNA），柔和混勻;

3. 混勻SiMi Transfection Reagents試劑，用50μl無血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無血清培養(yǎng)基）稀釋1μl SiMi Transfection Reagents試劑（DNA轉(zhuǎn)染時(shí)，則加入2μl SiMi Transfection Reagents試劑），輕輕混勻，室溫放置5分鐘;

4. 將稀釋好的siRNA和SiMi Transfection Reagents試劑混合;輕柔混勻，室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/SiMi Transfection Reagents（或DNA/SiMi Transfection Reagents）復(fù)合物。

5. 再加入400μL細(xì)胞懸浮液（細(xì)胞數(shù)量決定于細(xì)胞類型和轉(zhuǎn)染后分析測試的時(shí)間）。

6. 細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育24h-48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它檢測步驟。如果細(xì)胞株比較敏感，孵育4-6小時(shí)后，除去復(fù)合物，更換培養(yǎng)基。

<, FONT, face="Tahoma">H.DNA和siRNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞程序

1. 在轉(zhuǎn)染的前一天，4-5?104細(xì)胞接種在24孔板上，0.5 mL含F(xiàn)BS和抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基。

2. 選擇用于初期接種的細(xì)胞密度，應(yīng)能在24小時(shí)內(nèi)使細(xì)胞匯合達(dá)到70-90%。

3. 在100μL的無血清的培養(yǎng)基中稀釋20pmol siRNA和0.2μg DNA，加入2μl SiMi Transfection Reagents試劑，充分混合，放置20分鐘,以便形成siRNA/ DNA/SiMi Transfection Reagents復(fù)合物。

4. 將siRNA/ DNA/SiMi Transfection Reagents復(fù)合物加入培養(yǎng)基中，輕輕混勻。

5. 細(xì)胞在37℃溫育24h-48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它步驟。

I.siRNA體內(nèi)導(dǎo)入方法

1. 適量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的無菌水中，輕輕混勻，因?yàn)樽⑸湟后w積有限，建議采用高濃度的siRNA或DNA，一般DNA為2μg /μL、siRNA為10μg /μL。

2. 取適量的DNA、siRNA或siRNA\DNA復(fù)合物與SiMi Transfection Reagents混合。例如，在1#管中加入0.5μL的DNA（1μg）和0.5μL的siRNA（5μg），在2#管中加入0.55μL的SiMi Transfection Reagents（24μg）和0.45μL不含RNA酶的無菌水中，將1#管中的溶液加入2#管中，在室溫下溫育30分鐘，以形成siRNA/DNA-SiMi Transfection Reagents復(fù)合物。

3. 制備的siRNA/DNA-SiMi Transfection Reagentse復(fù)合物可用于體內(nèi)導(dǎo)入siRNA、DNA或siRNA\DNA。