酵母細胞質粒提取步驟和破壁技巧

【資料簡介】

酵母細胞的細胞壁比較厚，不容易破壁，不如大腸桿菌的質粒容易提取，zui近做了些釀酒酵母的實驗，從釀酒酵母中提取質粒，現在就總結下實驗的方法和步驟。

酵母細胞質粒提取步驟

1. 接種單菌落（待檢測酵母細胞）于25mLYNB（補加氨基酸營養物）培養基中，30℃振蕩培養過夜。

2.第二天取一滴菌液于進行顯微鏡下觀察,目鏡用16,物鏡用40倍觀察細胞壁破碎前的狀態,其成桿狀,流動性比較下.

3.取10ml的培養酵母菌液,5000g離心3min,棄上清液.加入5ml的1倍TE懸浮.

4.將懸浮液倒入高壓破壁儀的樣品管中,利用高壓破碎機進行破碎細胞壁,壓力加到20Mpa,停留15s,降壓,反復來回壓3次.取出細胞液,取一滴于顯微鏡下觀察,如果細胞呈不規則的球狀時,而且其流動性 比較大,說明其細胞壁已經破碎成為原生質體.

5.取2個EP管,每管加入1.5ml上述的細胞液,12000g離心5min,收集原生質體.棄取上清液,每管加入300ul10%的SDS溶液,混勻冰浴5min,進行破原生質體.

6.然后加入150ul的tris飽和酚,和150ul的鹵仿異戊醇混合液（鹵仿:異戊醇=24:1）,混勻,12000g,離心10min.

7.將水相移到另一EP管中,加入等體積的鹵仿異戊醇混合液（鹵仿:異戊醇=24:1）, 混勻,12000g,離心10min.

8. 將水相移到另一EP管中,加入1/10體積的3M KAC溶液和2倍體積的無水乙醇,放入-20℃冰箱中

9.1h,12000g離心10min,倒出乙醇,等干燥后加入1ml的70%的無水乙醇,混勻,12000g,離心10min.

10.棄去乙醇,等室溫干燥后,每管加入20ul的TE溶液（如要去處RNA酶,加入1ul的100mg/ml濃度的RNA酶）,放入-20℃冰箱即可.

11.跑電泳進行檢測是否從酵母菌中提出質粒了.

酵母破壁方法

我給你介紹兩個必叫簡單點的酵母破壁方法，非常實用，我作過很多實驗，這兩個方法是我自己總結出來的，希望對你有用。

酵母的細胞壁比較厚,不易破，而且細胞壁中含有的一些成分容易影響以后的實驗，所以破壁的步驟非常關鍵!其他步驟只要你按照說明就可以了。

1. 酚氯仿劇烈振蕩方法破壁：培養好的1ml酵母細胞在STE溶液中洗滌兩次后，用70ulTE緩沖液重旋!加入50ul玻璃珠（sigma公司），加入80-100ul酚氯仿，劇烈振蕩5-10分種后，使用氯仿抽取去除酚和蛋白，然后按照其他步驟沉淀就可以得到你的質粒，DNA的提取也可以使用這種方法。

2.反復凍融破壁：培養好的1ml酵母細胞在STE溶液中洗滌兩次后，加入200ul緩沖液[2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl （pH 8.0）, 1 mM EDTA （pH 8.0）]，使用液氮和96-98度沸水反復凍融3-5次，然后使用酚氯仿抽提蛋白!其余步驟參考其他文獻

3.下面兩個文獻對你會有所幫助!請參考!不錯的方法!

For yeast plasmid extraction we use the following method:

Buffer A: 100 mM NaCl 10 mM Tris-HCl （pH 8） 1 mM EDTA 0.1 % SDS

1. Culture the plasmid-harboring cells overnight in 1 - 2 ml of medium. Cells with 1 - 4 OD600/ml are needed.2. Pulse 5-10 sec at 15'000 rpm （maximum speed） （in an Eppendorf tube）.3. Throw away the supernatant.4. Resuspend in 200 µl of buffer A, keep cells on ice.5. Add glass beads just before the solution surface, mix with a vortex during 1 minute and sonicate.6. Add 200 µl of phenol.7. Vortex another minute.8. Centrifuge at 15'000 rpm for 1 minute.9. Throw away the phenol phase.10. Add 200 µl of phenol and reextract the same way.11. Take the water solution （about 200 µl） which contains the plasmids and treat with Glassmilk: add 600 µl of NaI solution and 5 µl Glassmilk suspension, put the tubes on the wheel for 5 min., then pellet the Glassmilk/DNA complex （pulse 5 sec）, remove the supernatant and set aside, then wash the pellet 3 times with 300 µl New Wash, then pulse for 5 sec to remove the New Wash.12. Elute the DNA into water （20 µl） or TE buffer.

When not using the GeneClean-kit, another protocol can be applied:Steps 1 to 9 remain the same as above. Then:

10. Add 200 ml phenol/chloroform 1:1 and vortex.11. Centrifuge at 15'000 rpm for 1 minute.12. Throw away the phenol phase.13. Add others 200 µl of chloroform and reextract the same way.14. Take the water phase and adjust the volume to 400 ml with water.15. Add 40 ml 3M NaCl.16. Add ca. 1 ml of ethanol 100 %.17. Put the tube at -20 0C for about 10 min..18. Centrifuge at 4 0C for 10 min. at maximum speed.19. Throw away the supernatant.20. Wash the pellet once with ethanol 80 % and once with ethanol 100 %.21. Dry the pellet by putting the tube upside down on a Kleenex.22. Resuspend the pellet in 50 ml TE buffer.

酵母質粒提取可以用試劑盒提取，也可以直接用裂壁酶處理后采用堿裂解法提取質粒，缺點就是提取的量很少，還會容易出現假陽性現象，明明有卻條帶，檢測卻不正確。