公司Southern blot實驗安排總結

【資料簡介】

 

 Southern blot是分子雜交常用的技術，對于小編來說這可是浩大的工程，合理有序的實驗安排是非常有必要滴。否則，一不小心，幾天的心血的以下是搜集的有關Southern blot 實驗安排，供參考。

Southern blot 實驗安排
酶切及轉膜：
*天晚上：
酶切過夜
第二天：
跑電泳，看酶切效果。50V，6小時。轉移過夜。
同時準備吸水紙、Watmamm 3mm的濾紙、尼龍膜、磁盤、玻璃板、
剪刀、鈍頭鑷子、鉛筆、小的飯盒
配置試劑：
20×SSC：
NaCl 175.3g
檸檬酸鈉 88.2g
溶于800ml水中，調PH值至7.0，定容至1L，滅菌。
20%SDS
在400ml中加入100gSDS，定容至500ml。
變性液緩沖液
0.4mol/L NaOH
將12.8g NaOH溶于水中，定容至800ml。
2×SSC
將10ml20×SSC溶于水中，定容至100ml。
0.5×SSC/0.5%SDS
2.5ml 20×SSC和2.5mlSDS溶于水中，定容至100ml。
1M phosphate Buffer PH6.8
1M Na2PO4（FW 142） 1M NaH2PO4（FW120）
稱：0.1L×1M×142=14.2g 0.15L×1M×120=18g
溶于水中，定容至100ml。溶于水中，定容至150ml。
zui后按Na2PO4：NaH2PO4=46.3：53.7=92.6ml：107.4ml 配200ml
第三天：
將尼龍膜用2×SSC 將但潤洗，再用煮沸的0.5×SSC/0.5%SDS漂洗兩次至溴酚藍顏色消失。置于濕潤的濾紙上，結合有DNA的一面向上，微波爐內烘烤至濾紙與膜自然分離（約2分鐘）。膜用保鮮膜包裹后存在4度待用。
雜交過程實驗安排：
前一天領鑰匙，登記。
*天：
預雜交及雜交液：
（注：BSA要求新鮮配置，要先溶解后混合，不然很難溶解）
配50ml
1%BSA 0.5g（先加5mlddH2O溶解）
7%SDS 20%SDS17.5ml
0.5M Phosphate buffer 1M：25ml
1mM EDTA 0.5M：100µl
鮭魚精DNA 100µg/µl 10mg/ml：50µl
ddH2O溶解至45ml，與5ml 1%BSA混合，定容至50ml水中。
洗膜液I（磷酸系統） 100ml
BSA 0.5% 0.5g
EDTA 1mM 0.5M:200µl
NaHPO4（PH7.2） 40mM 1M:4ml
SDS 5% 20%:25ml
洗膜液II（磷酸系統） 100ml
EDTA 1mM 0.5M:200µl
NaHPO4（PH7.2） 40mM 1M:4ml
SDS 5% 20%:25ml
雜交：門卡、衛生紙、濾膜（預先剪好）、鑰匙、同位素探測儀、報紙、剪刀、10小條封口膜、計時器、冰盒+冰、袖筒、垃圾袋、鑷子（已有）、手套、多個浮板
洗膜：X光片夾、保鮮膜
注意:封口膜一定要先撕好了。
浮板尺寸要合適。
1、預雜交：
取膜，結合有DNA的一面朝下，放于預熱的預雜交液中，65度4個小時。
2、探針標記：
（1） 在0.5ml離心管中加入下列試劑,95℃加熱3分鐘，迅速置于冰中，放置5分鐘。
探針 8μl
Random Primer 2μl
dH2O 4μl
（2）加入10×Buffer，dNTPMixture 2.5μl,用于標記的dCTP 5μl。
（3）加入1μl Exo-free Klenow Fragment，37℃反應10分鐘。
（4）65℃加熱5分鐘使酶失活。
（5）95℃加熱3分鐘迅速置于冰中冷卻。
（6）取適量的反應液直接作為探針使用。
3、雜交
將標記好且已經變性的探針加入雜交液中，65度雜交14～16小時，間或搖動一下。
4、洗膜：
雜交完后，分別用洗膜液I室溫下洗20分鐘，洗膜液II室溫下和65度各洗20分鐘。洗完后稍微干燥晾干雜交膜（不可*干燥），用保鮮膜包裹后通過放射性探測器測量雜交信號的強弱，放于X光片夾中。
5、壓片，洗片：
壓片1～2天，先顯后定。
蛋白SDS-PAGE電泳
原理：蛋白被變性和失去電荷后其遷移率只與蛋白分子量大小有關。
電泳儀：寧波新芝科器研究所MV-II型雙垂直擬電泳槽
試劑配制：
清洗玻璃板：先用蒸餾水沖洗，再用脫脂棉醮無水乙醇擦拭玻璃表面，晾干。
配置10%過硫酸銨溶液（APS）：稱取0.1g過硫酸銨（Ammonium Persulfate），加水至1ml。
事先配好的各項母液：10%（w/v）SDS 溶液：稱取10克SDS，溶于100 ml蒸餾水，微熱使溶解。
1%（v/v）TEMED溶液：取1 ml的TEMED（即N，N，N‘，N’-四甲基乙二胺），稀釋至100ml。儲存于深色瓶內，4℃保存。
10%過硫酸銨：（NH4）2S2O8（簡稱AP）1克溶于10 ml水，用前配制。
蛋白質樣品處理液：（不連續系統）
a. 先配制0.5 M pH 8.0 的Tris-HCl buffer：0.61g Tris溶于50 mlddH2O，用1M 鹽酸調pH。
b. 10% SDS溶液2 ml，
0.5 ml,
Sucrose 4 g,（or 甘油1 ml）
溴酚藍 2 mg，
0.05M Tris-HCl buffer, 加水至總體積 10 ml （1×）
電極緩沖液：含0.1% SDS的0.05 M Tris-0.384 M Gly buffer, pH 8.3
6.0 g Tris
28.8 g Gly
10% SDS 10 ml , 加水稀釋到1升
凝膠緩沖液：
a. 濃縮膠緩沖液：
0.5 M，pH 6.8 Tris-HCl buffer：
稱取6.0 g Tris，加入50 ml 水溶解，用1M鹽酸調pH，定容至100 ml。
b. 分離膠緩沖液：
1.5 M，pH8.8 Tris-HCl buffer：
稱取18.2 gTris，用少量水溶解，加入鹽酸25 ml，再用鹽酸調pH，加水定容100 ml。
凝膠儲備液：
a. 濃縮膠儲備液：
10%丙烯酰胺- 0.5%甲叉雙丙烯酰胺溶液：
10gAcr, 0.5g Bis, 溶于100ml水，濾去不溶物，儲存于深色瓶中。
b. 分離膠儲備液：
30%Acr–0.8%Bis溶液：
30g Acr , 0.8 g Bis, 溶于100ml水，過濾，儲于深色瓶內。
分離膠的配制：按下述配方配制15ml，灌注9ml為佳。
SDS-PAGE 不連續垂直平板電泳：
試劑：蛋白質標準Marker
10% （w/v）SDS 溶液
1% （v/v）TEMED溶液
10% 過硫酸銨
蛋白質樣品處理液
電極緩沖液
凝膠緩沖液
凝膠儲備液
SDS-不連續系統分離膠和濃縮膠的配制：

試劑名稱	配制30 ml 不同濃度的分離膠所需的試劑量（ml）					配制10ml5%濃縮膠所需試劑（ml）
	7%分離膠	10%分離膠	12%分離膠	15%分離膠	20%分離膠
分離膠儲備液	7	10	12	15	20
分離膠緩沖液	7.5	7.5	7.5	7.5	7.5
濃縮膠儲備液						5
濃縮膠緩沖液						2.5
10%SDS溶液	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.1
1%TEMED	2	2	2	2	2	0.8
蒸餾水	13	10	8	5		1.5
10%過硫酸銨	0.2 0.2 0.2 0.2 0.1

1. 在分離膠灌注后的界面上加約0.5ml正丁醇，形成界面即可。待分離膠聚合后用濾紙吸出正丁醇，用ddH2O沖洗分離膠面兩次。
2. 濃縮膠的配制：按上述配方配制5ml，灌注2~3ml即可。
3. 電極緩沖液的配制：（5X，200ml）28.8g ，6.04g Tris, 10ml 10%SDS，pH應在8~9之間。
4. 染色液的配制：0.25%考馬斯亮藍R-250（COOMASSIE R250），50%甲醇，7%乙酸水溶液。
5. 上樣緩沖液：上樣緩沖液也可用以下配方：濃縮膠緩沖液1.0ml、甘油0.8ml、10%SDS1.6ml、2-ME0.4ml、0.025%（W/V）溴酚藍0.2ml、水4.0ml或濃縮膠緩沖液1.0ml、甘油0.8ml、10%SDS3.2ml、2-ME0.4ml、0.025%（W/V）溴酚藍0.2ml、水2.4ml。臨用前加入2%  （2-ME, 2-Mercaptoethanol），Protein樣品與上樣緩沖液1:1混勻后100℃加熱3~5分鐘，降至室溫后高速離心3分鐘，取上清加樣。每孔點樣量以30ul為宜。
6. 電泳：1X電極緩沖液約400ml，電壓100V，電流處在20~40mA之間，約3~4小時后電泳完畢。
7. 將玻璃板撬開后染色2~3小時，回收染色液。
8. 過夜脫色或脫色3~4小時，脫色液配方：7%乙酸，30%甲醇的水溶液。
9. 拍照處理或凝膠成象，記錄結果。
10. 干膠：脫色后的凝膠用30%甲醇、7%乙酸、2~5%甘油的水溶液振蕩處理1小時，取兩張在水中浸泡過1分鐘的醋酸纖維膜平鋪于干膠器上，凝膠處于兩膜之間，用玻璃棒滾動除去氣泡，壓上干膠框，四周夾上夾子，風干或干燥箱干燥24小時以上。
細胞核大片段DNA的提取方法
準備
1. 滅菌：3個500 ml燒杯，研缽，小鑰匙，5 ml離心管，10 ml 離心管，5 ml槍頭，剪口1 ml 槍頭;
2. 酒精處理：100 ml離心管，小鐵鏟，模具;
3. 清洗尼龍膜：洗干凈SDS，小燒杯，玻璃棒;
4. 核分離緩沖液（NIB），裂解Buffer，TE預冷;
5. 液氮， 10g 以上材料，冰。
具體操作：
1. 在液氮中將材料研磨成粉末，盡量磨碎;
2. 在燒杯中加入核分離Buffer，預冷，按10ml/g加入;
3. 將粉末加入燒杯中，用玻璃棒輕輕攪勻，分散成塊的粉末，冰上靜置10 min;
4. 將混合物在單層大孔徑尼龍膜上過濾：在液體濾過以后，帶手套將尼龍膜卷起輕輕擠壓，擠出殘留液體;
5. 液體在雙層尼龍膜上再過濾一次;
6. 加入1/20體積的核分離Buffer（含10% Triton），輕輕攪勻，靜置10 min：時間不能延長，Triton的量不能增加，否則易使核破裂;
7. 4000 rpm離心10 min，小心倒盡上清：上清中可能還帶有白色顆粒狀的懸浮物，這是Triton與蛋白的結合物;
8. 加入50 ml核分離Buffer，重新懸浮沉淀，4000 rpm離心10 min;
9. 加入50 ml NIB，懸浮沉淀， 4000 rpm 離心10 min;
10. 配制1-1.2%低熔點瓊脂糖（LMT agarose）
11. 盡量除去上清，將混合物置于42℃中平衡，在沉淀混合物中加入等體積的LMT agarose（65℃） 小心用剪口1 ml槍頭混勻，將混合物注入模具中（模具預冷），要快，否則會凝固于管中;
12. 配制裂解Buffer
13. 將包埋成塊推出，浸入裂解Buffer，置于50℃，24h后更換裂解Buffer，再置于50℃處理24h;
14.

100 ml： 1．TE（PH8.0）在冰上洗滌三次，每次20min； 2．含1 mM PMSF的50 ml TE（PH8.0）冰上洗滌1h 3．5 ml TE（PH8.0）存放于4℃ 3

洗滌包埋塊：注意事項：
1. 所有用具，器皿，溶液都要預冷;
2. 全部操作都要在冰上進行，除包埋塊的澆注和核破裂的過程
3. 動作一定要輕柔而快速。
核分離Buffer

	終濃度	母液	100 ml 所用量
Tris—HCl（PH9.5）	10 mM	1M	1 ml
EDTA	10 mM	0.5M	2ml
KCl	100 mM	1M	10ul
Sucrose	0.5M		17.11g
Spermidine 亞精胺	4mM	0.2M	2ml
Spermine 精胺	1.0mM	0.1M	1ml
Mercapto-ethanol 巰基乙醇			100ul
Triton X-100			10ml

裂解Buffer

	終濃度	母液	10ml
Sarkosyl十二烷基肌氨酸鈉	1%	20%	0.5ml
EDTA（PH 8.0）	0.25M	0.5M	5ml
Proteinase K	0.2mg/ml		2mg

1mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液
【配制方法】
用異丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分裝成小份貯存于-20℃。如有必要可配成濃度高達17.4mg/ml的貯存液（100mmol/L）。
【注意】
PMSF嚴重損害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進或通過皮膚吸收后有致命危險。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，應立即用大量水沖洗之。凡被PMSF污染的衣物應予丟棄。
PMSF在水溶液中不穩定。應在使用前從貯存液中現用現加于裂解緩沖液中。PMSF在水溶液中的活性喪失速率隨pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值為8.0時，20μmmol/l PMSF水溶液的半壽期大約為85min，這表明將PMSF溶液調節為堿性（pH>8.6）并在室溫放置數小時后，可安全地予以丟棄。