抗體不同免疫化學方法的比較

【資料簡介】

（一）免疫印跡
    在免疫印跡技術中影響特定抗體效果的三大因素是實驗過程中抗原的變性、在硝酸纖維膜上抗原的呈現和抗體的特異性，這些特點將影響抗體發揮作用。
    在所有免疫化學技術中，抗原結構變化是影響免疫印跡試驗的zui重要因素。在免疫印跡中，任何來源的蛋白質都需要在嚴格條件下進行變性（通常是在2％SDS中煮沸）。通過SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離后，轉移到硝酸纖維膜上，然后通過抗體結合定位。抗原的三維結構在SDS中煮沸時被破壞，  由于硝酸纖維膜的物理附著以及與膜上蛋白結合的殘留SDS的持續存在，復性的可能性不大。因此，用這種方法可以使抗原*變性，只有那些氨基酸線性延伸所形成的表位才有利于抗體的結合。
           因為免疫印跡實驗較快速，檢測不同的抗體以確定其效應比較簡單，容易選擇僅與相應抗原及其密切相關蛋白成員發生相互作用的良好抗體。必要時，通過仔細選擇抗體可以區分相應抗原及其密切相關的蛋白。
（二）免疫沉淀和免疫親和純化
    兩種方法的抗體—抗原相互作用基于相似的物理原理，所以在這里一并討論。兩種方法通常用于收集溶液中的天然抗原，由于表位被破壞，阻礙抗體達到的空間位阻以及抗體對抗原的親合性等問題使這兩種方法復雜化。
    因為免疫沉淀和免疫親和純化通常用于收集天然狀態的蛋白抗原，因此變性常破壞其抗體的識別位點。為使表位的破壞減少到zui低程度，應該選擇提取條件以便找到能充分釋放抗原的zui溫和條件。
    這些方法不僅用于待收集的抗原研究，并可用于收集相關分子。對免疫沉淀尚處于分析階段，而免疫親和純化則已用于大規模分離。對抗體的評價，應以從溶液中去處的總抗原量的部分為依據。
    （三）細胞染色和組織染色
    對培養的細胞或有機體的細胞染色，選擇有用的抗體極為重要，文獻報道了很多由于抗體選擇不當，而得出亞細胞定位和抗原存在的不準確結論。免疫染色的方法學涉及到抗體的特異性、表位結構的改變以及抗體與抗原結合的空間位阻問題。
       影響免疫染色成功的一個關鍵因素是難以確定某一特定抗體的特異性。免疫沉淀或免疫印跡是通過抗原的相對分子量來分離抗原；免疫親和純化方法，其蛋白質也常用凝膠電泳來檢測其純度。這為研究人員從非目的的相互作用中區分有目的的相互作用提供了另一種方法。        

       免疫染色的zui后一個問題是抗體易接近性的空間位阻。這包括靶抗原與其他分子相互作用封閉關鍵表位的獲取，以及細胞結構的存在影響抗體充分達到抗原部位，這些問題是免疫染色方法中所固有的。在設計實驗和對照組時采用蛋白酶和微波處理可以減少空間位阻，但如何控制其強度，需要在實驗中摸索。