兔腫瘤壞死因子αelisa檢測試劑盒技術參數

【資料簡介】

　　兔腫瘤壞死因子αelisa檢測試劑盒說明書
 

　　樣本實驗前準備：
 

　　ELISA試劑盒液體樣本：包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養上清等。
 

　　(1)血清
 

　　室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
 

　　(2)血漿：
 

　　應根據標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
 

　　(3)尿液：
 

　　用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。
 

　　(4)細胞培養上清：
 

　　檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。
 

　　(5)培養細胞
 

　　檢測細胞內的成份時，用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
 

　　(6)組織標本
 

　　切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4)，或組織蛋白萃取試劑, 用手工或勻漿器將標本勻漿化。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
 

　　elisa試劑盒常見組成部分：
 

　　1)酶和底物：在ELISA中zui常用的酶為HRP和ALP。
 

　　2)抗體：在ELISA中應用的抗體可分為多克隆抗體(多抗)和單克隆抗體(單抗)。
 

　　3)抗原：在ELISA中應用的抗原要求有較高的特異性、親和力和純度。主要有三類，即自然抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。
 

　　4 人E選擇素(E-Selectin/CD62E)檢測試劑盒包被：將免疫活性物質(抗原或抗體)結合于固相載體上的過程稱為包被。常用的材料有聚苯乙烯、硝酸纖維薄膜等；常用的方法有吸附法、化學交聯法及親和素間接包被法
 

　　5)固相載體：固相載體是ELISA中用以分離結合標記物和游離標記物的主要手段，應與各種免疫活性物質有良好的結合性能并且不改變其免疫活性。常用的固相載體有聚苯乙烯塑料和硝酸纖維素膜。
 

　　操作步驟
 

　　1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在di一、第二孔中分別加標準品100μl，然后在di一、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從di一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為180 ng/L，120 ng/L ，60 ng/L，30 ng/，15 ng/L)。
 

　　2. 加樣：分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
 

　　3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
 

　　4. 配液：將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用。
 

　　5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
 

　　6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
 

　　7. 溫育：操作同3。
 

　　8. 洗滌：操作同5。
 

　　9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
 

　　10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(此時藍色立轉黃色)。
 

　　11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液后15分鐘。
 

　　注意事項
 

　　1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
 

　　2. 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
 

　　3. 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間好控制在5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
 

　　4. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
 

　　5. 底物請避光保存。
 

　　6. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
 

　　7. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
 

　　8. 本試劑不同批號組分不得混用。
 

　　9.如需代測或者樣本暫時不測定，可立即低溫凍存，溫度越低越好，中間避免反復凍融，-20℃以下可保存三個月,-70℃以下可保存六個月。
 

　　10.試劑使用須知：
 

　　11.(1)請參照相關法規、文獻、MSDS等信息，理解并掌握好試劑的特性，再進行安全操作。
 

　　12.(2)通常購買試劑時一定要想到一次性用完。若估算不足有剩余的話，更加注意其他保管和管理。
 

　　13.(3)萬一試劑操作者并非專業技術人員。必須在專業人士的指導監督下進行操作。對于使用后的廢棄物，不要或者舊的試劑，應按照相關法律法規正當處理。
 

　　14.(4)購買后，請務必確認標簽上的注意事項；做好預防顛倒，摔壞的措施和管理體制；在使用前再次確認標簽上的注意事項，做好必要的安全對策；對沒有標明其危害特性、有害特性的，也要慎重地進行操作；必須帶好防護用具，小心翼翼進行操作。