非洲豬瘟試劑盒的工作原理

【資料簡介】

非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒使用說明書（快提核酸擴增試劑盒）

【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒（PCR熒光探針法）
英文名稱：Diagnostic Kit for African Swine Fever Virus （PCR Fluorescence Probing）

［預(yù)期用途］
本試劑盒主要用于檢測疑似感染豬抗凝血及臨床病料中的非洲豬瘟病毒（ASFV, African Swine FeverVirus）核酸，適用于非洲豬瘟病毒的檢測、輔助診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

【試劑盒組分】
1、試劑盒組成及貯藏條件

名稱	50T	貯藏條件
1、反應(yīng)液A	ImL	-20°C
2、反應(yīng)液B	ImL
3、陽性對照	250μL
4、陰性對照	250μL
5、PCR反應(yīng)液	850μL
6、酶混合液	150μL

2、需自備材料：生理鹽水、無菌槍頭、熒光PCR專用反應(yīng)管、記號筆等。

【操作步驟】

一、樣品制備
1、 血液樣品：采集抗凝血（抗凝劑為EDTA）或血清樣品，編號備用。
2、 組織樣品：采集脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、扁桃體等病變組織樣品或軟蜱0.1g（黃豆粒大小），眼科剪剪碎于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，再加1mL生理鹽水混勻，4°C條件下8000 rpm/分鐘離心2分鐘，取上清液于滅菌離心管中，編號備用。

二、DNA提取
取反應(yīng)液A 20μL分別加入到新的1.5mL離心管，加入抗凝而或血清或組織上清液2μL混勻，室溫（20°C左右）靜置3分鐘，加入反應(yīng)液B 20μL,吹打混勻即可，若為抗凝全血，則需8000rpm/分鐘再離心2分鐘后做為待檢DNA溶液。

二、PCR擴增
1、配液：取出PCR反應(yīng)液、酶混合液，在室溫*融化后，充分混勻，瞬離，可將酶混合液全部取岀直接加入到PCR反應(yīng)液中，充分混勻，瞬離后按每份20μL分裝使用；或按照每份PCR反應(yīng)液17μL, 酶混合液3μL的比例取一定的試驗用量，混合兩種反應(yīng)液,瞬離后按照每份20μL分裝到專用熒光PCR 反應(yīng)管中，剩余試劑立即凍存；（操作過程要注意避光）
2、加樣擴增：分別向上述PCR反應(yīng)管中加入5μL樣本 DNA或陰性對照或陽性對照，混勻并瞬離, 放入熒光PCR儀上運行以下程序：

步驟	條件	循環(huán)數(shù)
50°C：2分鐘	95 1
預(yù)擴増	°C：8 秒  5
95°C：8 秒  40

熒光通道選擇FAM,在40循環(huán)階段每個循壞的55°C時收集熒光信號。設(shè)置擴增體系為25μL,同時要選擇 passive reference 和 quencher 為 none 的模式。
(注:若熒光PCR儀(如ABI7500)按說明書中的反應(yīng)程序設(shè)置后因持溫時間短無法運行,可將預(yù)擴增和PCR擴增條件變更為95°C： 5秒 55°C：30秒。) 

【結(jié)果判定】
1、基線和閾值設(shè)定；基線調(diào)整取6-15個循環(huán)的熒光信號，閾值設(shè)定以閾值線剛好超過陰性對照檢測 熒光曲線的最高點為原則。
2、質(zhì)量控制：反應(yīng)結(jié)束后，陰性對照的檢測結(jié)果應(yīng)無特定的擴增曲線，Ct值為＞38或無；陽性對照 的Ct值應(yīng)≤30.0,且明顯的擴增曲線；否則實驗視為無效。
3、樣品判定：待檢樣品熒光信號有指數(shù)型增加，且結(jié)果顯示Ct值<35.0,報告為陽性；未檢測到Ct 值或Ct值＞38或無明顯擴增曲線，則樣品判定為陰性。35≤Ct值≤8時，復(fù)檢一次，重復(fù)結(jié)果為陽性者判定為陽性，否則判定為陰性。