致瀉性大腸埃希氏菌五重 PCR 試劑盒

【資料簡介】

產品名稱：致瀉性大腸埃希氏菌五重 PCR 試劑盒產品規格：50T/盒

產品貨號：KLP08-A0231

 

產品簡介：

大腸埃希氏菌是一類能引起人體以腹瀉癥狀為主的病原菌，常見的致瀉大腸埃希氏菌主要包括腸道集聚  性  大  腸  埃  希  氏  菌（  enteroaggregative Escherichia coli, EAEC  ）、 腸  道  致  病  性  大  腸  埃  希  氏  菌（enteropathogenic Escherichia coli， EPEC）、產志賀毒素大腸埃希氏菌(shiga  toxin-producing  Escherichia  coli,  STEC) (包括腸道出血性大腸埃希氏菌（enterohemorrhagic  Escherichia  coli，EHEC）)、產腸毒素大腸埃希氏菌（enterotoxigenic  Escherichia  coli，ETEC）、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（enteroinvasive  Escherichia  coli,  EIEC）。該菌廣泛存在于自然界，當其污染食品或水源后，可引起細菌性食物中毒或水源性腹瀉病爆發流行，所以致瀉大腸埃希氏菌的檢測對社會衛生健康具有極大的意義。

為了滿足致瀉大腸埃希氏菌檢測及研究的需要，本公司根據標準  GB4789.  6  合成了致瀉大腸埃希氏菌特征性基因特異性引物，并優化形成本試劑盒。應用本試劑盒進行檢測具有快速、靈敏、特異、準確、操作簡單等特點及優點。

 

包裝規格及成分：

 

編號	成分	規格
試劑一	致瀉大腸埃希氏菌五重 PCR 反應液	1 mL×1 管
試劑二	陽性對照	200 µL×1 管
試劑三	陰性對照	200 µL×1 管
使用說明書		1  份

 

運輸及保存：低溫運輸，-20℃保存。操作步驟：

一、樣本制備（參考  GB4789.  6）

固態或半固態樣品：固體或半固態樣品,以無菌操作稱取檢樣 25 g，加入裝有 225 mL  營養肉湯的均質杯中，用旋轉刀片式均質器以   8000  r/min~10000  r/min  均質 1 min~2  min，或加入裝有  225  mL  營養肉湯的均質袋中，用拍擊式均質器均質  1  min~2

 

min  。

液態樣品：以無菌操作量取檢樣 25 mL，加入裝有 225  mL  營養肉湯的無菌錐形瓶(瓶內可預置適當數量的無菌玻璃珠)，振蕩混勻。

二、增菌

將 1 制備的樣品勻液于 36℃±1℃ 培養 6 h，取 10 μL ,接種于 30 mL 腸道菌增菌肉湯管內，于 42℃±1℃培養 18 h 。

三、分離

將增菌液劃線接種 MAC 和 EMB 瓊脂平板，于 36 ℃±1 ℃ 培養 18 h~24 h ,觀察菌落特征。在  MAC   瓊脂平板上，分解乳糖的典型菌落為磚紅色至桃紅色，不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色；在 EMB 瓊脂平板上，分解乳糖的典型菌落為中心紫黑色帶或不帶金屬光澤，不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色，應挑取乳糖發酵，以及乳糖不發酵和遲緩發酵的菌落。

四、PCR  模板制備

• DNA 提取:使用 1 μL 接種環刮取營養瓊脂平板或斜面上培養 18 h~24 h 的菌落懸浮在 200  μL  0.  85%滅菌生理鹽水中，充分打散制成菌懸液，于  13000r  /  min  離心  3min，棄掉上清液。加入 1 mL  滅菌去離子水充分混勻菌體，于 100℃水浴或者金屬浴維持 10  min；冰浴冷卻后 13000  r  /  min  離心 3  min，收集上清液；按  1∶ 20 的比例用滅菌去離子水稀釋上清液，取 5 μL 作為 PCR 檢測的模板；可用細菌基因組提取試劑盒提取細菌 DNA，操作方法按照細菌基因組提取試劑盒說明書進行。
• DNA 保存:所有處理后的 DNA 模板直接用于 PCR 反應或暫存于 4 ℃  并當天進行PCR  反應；否則，應在-20  ℃  以下保存備用 1 周。也可用細菌基因組提取試劑盒提取細菌 DNA，操作方法按照細菌基因組提取試劑盒說明書進行。

五、試劑準備

• 擴增試劑準備（在反應混合液配制區進行）：從試劑盒中取出 PCR 反應液，解凍混勻，瞬離后向每個 PCR 管中各分裝 20 μL PCR 反應液，轉移至樣本處理區。
• 加樣（在樣本處理區進行）：在 PCR 反應管內加入 5 μL 制備的核酸樣本陽性對照或陰性對照，蓋上蓋子，輕彈混勻并瞬時離心后，立即轉移至檢測區進行反應。總反應體系如下表。

試劑	添加量（25 μL）
致瀉大腸埃希氏菌五重 PCR 反應液	20  μL
DNA 樣品/陽性對照/陰性對照	5  μL

 

六、PCR 檢測（在檢測區進行） 請按照下表設置反應程序：

階段	溫度設計			循環數
預變性	98℃	30	sec	1  ×
PCR 反 應	98℃	15	sec	30  ×
	55℃	30	sec
	68℃	10	sec
反應結束后，將產物進行  1.8%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后分析其條帶情況。

 

【結果判定方法】結果判定

1) 陰性對照：無目的基因條帶

2) 陽性對照：有目的基因 Stx1（244 bp）和 sth（171 bp）的明顯條帶。

致瀉大腸埃希氏菌類別	陽性基因名稱	片段長度（bp）
腸道聚集性大腸埃希氏菌（EAEC）	astA	102
腸道致病性大腸埃希氏菌（EPEC）	escV	544
產志賀毒素大腸埃希氏菌/腸道出血性大腸埃希 氏菌 （STEC / EHEC）	Stx1, escV+ Stx1	244 / 544+244
產腸毒素大腸埃希氏菌（ETEC）	sth	647
腸道侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）	ipaH	171

 

注意事項

1. 開始檢測前請仔細閱讀本說明書，按要求操作。

2. 組織樣品的樣本處理和核酸擴增應注意生物安全

3. 試劑使用前，應充分融化均勻后，瞬時離心；PCR 反應管避免反復凍融。

4. 加樣時應使樣品落入反應液中，不應有樣品黏附于管壁上，加樣后應盡快壓緊管蓋。

5. 經樣品前處理液處理過的樣本，不能用于樣本保存，僅用于即時檢測

6. 研磨組織樣本不宜過大，以防雜質含量高而抑制后續的 PCR 反應。

7. 樣品前處理液可置于 4℃保存。

8. 本產品只能用于科研實驗，不能用于臨床診斷。