硝酸還原酶的測定法

【資料簡介】

硝酸還原酶（NR）是植物氮素同化的關鍵酶，它催化植物體內的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,產生的亞硝酸鹽與對–氨基苯磺酸（或對–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。其反應如下：
生成的紅色偶氮化合物在540nm波長下有zui大吸收峰，可用分光光度法測定。硝酸還原酶活性可由產生的亞硝態氮的量表示。一般以Nμg·g-1·h-1為單位。NR的測定可分為活體法和離體法。活體法步驟簡單，適合快速、多組測定。離體法復雜，但重復性較好。
二、儀器與用具
分光光度計；真空抽氣泵（或20ml注射器筒）；天平；單面刀片；保溫箱（或恒溫水浴）；刻度試管（15ml）；移液管（5ml×2，2ml×8，1ml×2）。
三、試劑
1. *標準液 稱取分析純NaNO2 0.1000g水溶后定容至100ml，吸取5ml用水稀釋定容至1000ml，即為每ml含NaNO2 5μg（亞硝態氮近似1μg/ml）的標準液。
2. 0.1mol/L pH7.5的磷酸緩沖液：K2HPO4 19.24g，KH2PO4 2.2g，加水溶解后定容至1000ml。
3. 1%（W/V）對-氨基苯磺酸溶液：稱取1.0g加入25ml濃HCl中，用蒸餾水定容至100ml。
4. 0.2%（W/V）α-萘胺溶液：稱取0.2gα-萘胺溶于25ml冰醋酸中，用蒸餾水定容至100ml。
5. 30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml。
6. KNO3（0.1mol/L）、異丙醇（1% V/V）、磷酸緩沖液（0.1mol/L）混合液：稱3.03g KNO3溶于300ml 0.1mol/L的磷酸緩沖液中，再加3ml異丙醇混勻。
硝酸還原酶活力測定（活體法）
四、方法
1. 標準曲線制作
取7支潔凈烘干的15ml刻度試管按表13-1順序加試劑，即配成0-2.0μg的系列標準亞硝態氮溶液。搖勻后在30℃保溫箱或恒溫水浴中保溫30min，然后在540nm波長下比色。以亞硝態氮（μg）為橫坐標，光密度值為縱坐標繪標準曲線或建立回歸方程。
表13-1 各試劑加入順序
2. 酶反應和酶活性測定
（1）取樣：將材料（小麥、玉米等作物葉片）洗凈，用蒸餾水沖洗，濾紙吸干。在葉片中部打取直徑1cm的圓片（或剪成0.5~1.0cm2的小塊），混勻后每個樣品稱0.5~1.0g 3份，放入試管并編號。
（2）反應：向各試管加入KNO3·異丙醇·磷酸緩沖液混合液9ml，其中一管立即加1.0ml三氯乙酸混勻作對照。然后將所有試管置真空干燥器中接真空泵抽氣，反復幾次直至葉片沉在管底。將各試管置30℃下于黑暗處保溫30min，分別向處理管加1.0ml三氯乙酸，搖勻終止酶活性。
（3）比色：將各試管靜置2min，吸取上清液2ml加入另一組試管，以對照管做參比，按標準曲線做法進行顯色測定，并計算酶活性（Nμg·g-1·h-1）。
式中 C：反應液催化產生的亞硝態氮總量（μg）；
V1：提取酶液時加入的緩沖液體積（ml）；
V2：酶反應時加入的粗酶液體積（ml）；