酰基轉移酶（AAT）活性測定試劑盒

【資料簡介】

測定意義：

AAT是一個多功能蛋白大家族，主要負責催化生物體內各種酰基化和去酰基化反應，在基因表達、代謝和信號傳導中具有重要作用。

測定原理：

AAT催化乙酰CoA轉移乙酰基到丁醇，同時還原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，測定412nm吸光度增加速率，來計算AAT活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100 mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體25 mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1管，-20℃保存。臨用前加蒸餾水1mL充分溶解，4℃保存。

試劑四：液體2 mL×1管，4℃保存。

試劑五：粉劑×1管，4℃避光保存。臨用前加入試劑二1mL充分溶解，4℃避光保存。

粗酶液提取：

稱取約0.1g樣品，加試劑一1mL，冰上充分研磨，16000g 4℃離心20min，取上清液待測。

AAT測定操作：

1. 分光光度計預熱30min以上，調節波長到412 nm，蒸餾水調零；水浴鍋35℃預熱。

2. 對照管：依次在500μL EP管中依次加入140μL試劑二、10μL試劑三、20μL試劑四和10μL試劑五，20μL待測液，室溫放置10min后于412nm測定吸光度，記為A1。

3. 測定管：依次在500μL EP管中依次加入140μL試劑二、10μL試劑三、20μL試劑四和20μL待測液，35℃水浴15min，加10μL試劑五，室溫放置10min后于412nm測定吸光度，記為A2。△A測=A2-A1。

AAT活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

AAT活力單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.001個單位為1U。

AAT (U/mg prot) = 1000×△A測×V總÷(Cpr×V樣) ÷T= 666.7×△A測÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

AAT活力單位定義：37℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化0.001個單位為1U。

AAT (U/g 鮮重) = 1000×△A測×V總÷(V樣÷V樣總×W) ÷T= 666.7×△A測÷W

Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質濃度需要另外測定；V樣：加入反應體系中上清液體積，0.02mL；V總：反應總體積，0.2 mL；W ：樣品質量；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應時間，15min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

AAT活力單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.0005個單位為1U。

AAT (U/mg prot) = 2000×△A測×V總÷(Cpr×V樣) ÷T=1333.4×△A測÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

AAT活力單位定義：37℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化0.0005個單位為1U。

AAT (U/g 鮮重) = 2000×△A測×V總÷(V樣÷V樣總×W) ÷T= 1333.4×△A測÷W

Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質濃度需要另外測定；V樣：加入反應體系中上清液體積，0.02mL；V總：反應總體積，0.2 mL；W ：樣品質量；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應時間，15min。

注意事項：

上清液蛋白質含量需要另外測定。建議購買本公司生產的BCA蛋白質含量測定試劑盒。