關于ELISPOT試驗技術中對細胞的處理

【資料簡介】

 提取外周血淋巴細胞時注意事項

如果取外周血淋巴細胞 （PBMC） 進行ELISPOT檢測，采用新鮮血液。在保證無菌操作的前提下，首先應保證取血時抗凝劑應及時充分的與血液混勻，避免血凝塊的出現?？鼓皶r提取PBMC，避免放置時間過長，室溫下避免過夜。應選用分離效果好的淋巴細胞分離液，避免PBMC中混有過多其他細胞成分或雜質。

外周血出現溶血后，在使用淋巴細胞分離液分離PBMC時，溶血產生的細胞碎片、血紅素等雜質將極大可能懸浮于分離液的層面，在吸取PBMC時非常容易混入這些雜質，由于混入細胞的細胞碎片和血紅素很難清洗去除，在進行ELISPOT實驗時，有可能沉積在培養(yǎng)板底，嚴重影響細胞因子和抗體的結合，進而影響實驗結果。

分離外周血淋巴細胞適合于ELISPOT試驗方法
使用淋巴細胞分離液，推薦使用進口淋巴細胞分離液，如：Lymphoprep，或者NycoPrep 1.077（無寡糖）。避免使用紅細胞裂解液分離淋巴細胞。

從動物脾臟組織分離淋巴細胞
取動物脾臟組織時，應注意取材的無菌操作。分離出脾臟組織，研磨后過200目篩網，保證所分離的細胞為單個細胞懸液。獲得細胞懸液后應該使用相應的淋巴細胞分離液進一步分離單個核細胞。

在ELISPOT板上，每孔我應該放置淋巴細胞的數目
在使用ConA，PHA等陽性刺激孔中，一般放置的淋巴細胞數為 104～2×105。在使用抗原作為刺激劑的情況下，每孔細胞濃度可在1～4×105。在使用多克隆刺激劑的情況下，應適當調低細胞濃度。但由于所用刺激劑的強度和批號不同，建議初次進行ELISPOT檢測時，對刺激劑濃度和細胞濃度設立梯度，以保證較理想的實驗結果。

對淋巴細胞進行體外刺激預孵育、或板內同步刺激培養(yǎng)
1）將抗原和淋巴細胞在體外混合，刺激并預孵育，是通用的方法。預孵育的淋巴細胞，在置入ELISPOT板之前應使用復溫到37℃的培養(yǎng)液清洗細胞1-2次。置入ELISPOT板以后通常在37℃培養(yǎng)5～6小時。
2）對于高度特異性抗原，可以采用將淋巴細胞和抗原同時加入ELISPOT板孔中，37℃培養(yǎng)箱中，同步進行刺激、培養(yǎng)、和細胞因子捕獲。淋巴細胞板內同步刺激培養(yǎng)的時間通常為22～24小時。

ELISPOT試驗檢測的是每一個分泌細胞因子的活化細胞。在培養(yǎng)細胞過程中，任何移動、震動（包括開關培養(yǎng)箱門）都會導致細胞在培養(yǎng)板上的移動，從而得到不規(guī)則斑點或者斑點花紋，影響zui終結果。因此細胞在ELISPOT培養(yǎng)板孵育的過程中，應注意保持培養(yǎng)板的靜置，不應對其移動。

在使用抗原刺激淋巴細胞培養(yǎng)過程中發(fā)現培養(yǎng)液變黃，這種現象通常見于使用很強的多克隆抗原刺激淋巴細胞，某些多克隆抗原會導致淋巴細胞凋亡或者死亡，大量淋巴細胞死亡后使培養(yǎng)液變黃。使用這些淋巴細胞進行后續(xù)ELISPOT試驗通常得到很低的斑點（SPOT）形成。換用特異性抗原后可以避免該現象。

在ELISPOT結果中出現不規(guī)則的大塊斑點，有的區(qū)域沒有斑點的原因，不規(guī)則斑點區(qū)域的出現一般是細胞分離不*所至，有時候采用多克隆抗原孵育的淋巴細胞也會產生成團現象。請確認加入到ELISPOT板中進行孵育的是單細胞懸液。

使用開口較大的吸頭，動作輕柔，避免對細胞的吹打，減少剪切力對淋巴細胞的傷害。