傳染性鮭魚貧血病毒（ISAV）一步法 RT-PCR 檢測試劑盒說明書

【資料簡介】

1、傳染性鮭魚貧血病毒（ISAV）一步法 RT-PCR檢測試劑盒簡介 
貨號：HB-705-2 
為了適應(yīng)傳染性鮭魚貧血病（ISA）快速檢測和疫病研究的需要，本公司嚴格依據(jù) 2014 版
OIE 水生動物疫病診斷手冊規(guī)定的 ISAV 的 RT-PCR 檢測病毒的引物序列及其循環(huán)參數(shù)等技術(shù)標(biāo)
準，在本公司嚴謹?shù)漠a(chǎn)品質(zhì)量保證體系管控下生產(chǎn)和質(zhì)檢。確保本試劑盒滿足 OIE 中 ISAV 的檢
測標(biāo)準要求。本試劑盒具有快速靈敏、特異、準確、安全、操作簡單、應(yīng)用廣泛等特點及優(yōu)點。
2、試劑盒組成 
試劑盒組成包括核酸擴增試劑。具體組成參見表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
試劑盒組成成分 體積 
*： 核酸裂解液 15ml×2 管
核酸擴增試劑： DEPC 水
ISAV RT-PCR 反應(yīng)液
酶混合物
陰性對照
ISAV 陽性對照
1ml×1 管
750µL×1 管
60µL×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
（注：*可使用本公司生產(chǎn)的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》） 
3、樣本采集,存放及運輸 
3.1 樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干。
取新鮮魚類組織臟器（肝、腦、脾、腎）2g 于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加 5ml PBS混勻，2 000r/min 離心 10min 取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用。或取有可疑細胞病變的細胞懸液用于檢測。
3.2 存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；-70 ℃以下可*保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（zui多凍融 3 次）。
3.3 運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸。
4、一步法 RT-PCR 檢測 
4.1 樣本的處理（在樣本制備區(qū)進行）： 
4.1.1 取n個滅菌的1.5 mL Eppendorf管，其中n為被檢樣品與陰性對照的和（陽性對照、陰性對照在試劑盒中已標(biāo)出），做標(biāo)記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為一步法RT-PCR檢測的模板，無需提取核酸)4.1.2 每管加入 600 µL 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 µL，一份樣本換用一個吸頭，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過于強烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可以用手顛倒混勻），于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。
4.1.3 取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 µL 異丙醇（-20℃預(yù)冷），做標(biāo)記。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，上清液應(yīng)至少吸取 500µL，不能吸出
中間層，顛倒混勻。
4.1.4 于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加入 600 µL 75％
乙醇，顛倒洗滌。
4.1.5 于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置），小心
倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）。
4.1.6 4 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置），將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要碰
到有沉淀一面，室溫干燥 3 min，不能過于干燥，以免 RNA 不溶。
4.1.7 加入 11 µL 或 21 µL DEPC 水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉?RNA 須在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增; 若需*保存須放置-70 o
C 冰箱。【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書》（貨號：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷取核酸】。
4.2、傳染性鮭魚貧血病毒（ISAV）一步法 RT-PCR檢測試劑盒試劑準備 
4.2.1 擴增試劑準備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進行）：
從試劑盒中取出相應(yīng)的一步法RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR混合酶，在室溫下融化后，2 000 r/min
離心5 s。設(shè)所需一步法RT-PCR檢測總數(shù)為n，其中n為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和，每個樣
品測試反應(yīng)體系配制見下表2。
表 2 每個樣品測試反應(yīng)體系配制表
試劑 RT-PCR 反應(yīng)液 RT-PCR 混合酶
用量 15 μL 1.0 μL
根據(jù)測試樣品的數(shù)量計算好各試劑的使用量，加入到適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻，向每個
一步法RT-PCR管中各分裝15 μL，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
4.2.2 加樣（在樣本處理區(qū)進行）：
在各設(shè)定的一步法RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10μL，蓋
緊管蓋，500 r/min離心30s。
注：試劑盒中的陽性對照直接作為一步法RT-PCR檢測的模板，無需提取核酸。 
4.3、檢測（在檢測區(qū)進行）： 
將4.2.2中離心后的PCR管放入PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。循環(huán)條件設(shè)置如下：
*階段：42 oC/30 min；
第二階段：95 oC/3 min；
第三階段：95 oC/45 sec, 54 oC/1 min，72 oC/1 min, 35個循環(huán)；
第四階段，72 oC/10 min；
第五階段，4 oC 保存。 
4.4、瓊脂糖電泳 
用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面。將10μL樣品PCR擴增產(chǎn)物和相應(yīng)電泳上樣緩沖液（Loading Buffer）按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時設(shè)立DNA標(biāo)準分子量作對照。5 V/cm電泳約0.5 h，當(dāng)溴酚藍到達底部時停止。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴增初預(yù)期的特異性DNA電泳帶，拍攝并記錄。
5、結(jié)果判定 
5.1 ISA一步法RT-PCR后陽性對照出現(xiàn)一條304 bp的DNA片段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。
5.2 待測樣品在相應(yīng) 304 bp DNA 位置上有帶，可判陽性。無帶或帶的大小不是 304bp 的判為陰性。
6、傳染性鮭魚貧血病毒（ISAV）一步法 RT-PCR檢測試劑盒相關(guān)技術(shù)信息 
引物序列
ISAV F：5’-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3’
ISAV R：5’-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3’