3-磷酸甘油酸激酶試劑盒說明書

【資料簡(jiǎn)介】

3-磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK） 試劑盒說明書 
分光光度法 50管/48樣 
注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。 
3-磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK） 試劑盒說明書 測(cè)定意義 
3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的關(guān)鍵酶，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)，催化 1，3-二磷酸
甘油酸轉(zhuǎn)變?yōu)?3-磷酸甘油酸，產(chǎn)生1分子 ATP，具有影響 DNA復(fù)制和修補(bǔ)及刺激病毒RNA
合成等生物學(xué)功能，廣泛應(yīng)用于藥物靶標(biāo)設(shè)計(jì)。 
測(cè)定原理 
3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP產(chǎn)生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP， 1,3-二磷酸甘油
酸在 3-磷酸甘油醛脫氫酶和NADH 作用下產(chǎn)生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸，340nm處的吸
光度變化反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。 
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器 
天平、低溫離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計(jì)、1 mL石英比色皿。 
3-磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK） 試劑盒說明書 試劑組成和配制       
提取液：液體100mL×1 瓶，4℃保存。 
試劑一：液體 25mL×1 瓶，4℃避光保存。 
試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加 5mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后
-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。 
試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加 2.5 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝
后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。 
試劑四：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加 2.5 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝
后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。 
試劑五：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 10 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝
后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。 
酶液提取 
①總 PGK酶提取：建議稱取約 0.1g樣本，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，
200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間 1min） ，然后 4℃，500g離心 5min，取上清測(cè)定。 
②胞漿和葉綠體 PGK 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5～10 的
比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液），冰浴勻漿后于 4℃，500g 離心 5min，棄
沉淀，取上清在4℃，8000g離心 10min，取上清用于測(cè)定胞漿 PGK酶活性，取沉淀加1mL
提取液，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇7s，總時(shí)間1min） ，然后 4℃，
500g離心 5min，取上清測(cè)定葉綠體中 PGK酶活性。 
建議測(cè)定總PGK酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的PGK，
則按照步驟②提取粗酶液。 
測(cè)定操作 
1.  分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。 
2.  取 1mL石英比色皿，依次加入 500μL試劑一，100μL試劑二，50μL試劑三，50μL試劑
四，200μL試劑五，100μL粗酶液，充分混勻，記錄340nm處 10s的吸光值 A1和 310s
的吸光值 A2，△A=A1-A2 
 
3-磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK） 試劑盒說明書 計(jì)算公式 
（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算 
酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 
PGK（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr 
（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算 
酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 
PGK（nmol/min /g  鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W 
V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103
 L / mol /cm；d：比色
皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)
間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g