抗體/蛋白HRP標記制備試劑盒產品說明書

【資料簡介】

 

抗體/蛋白HRP標記制備試劑盒產品說明書

 

主要用途

 

抗體/蛋白HRP標記制備試劑是一種旨在通過高碘酸氧化產生活化的辣根過氧化酶，與抗體或蛋白中氨基偶聯反應，進一步還原和中和作用，確保復合體的穩定的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種種系的抗體、純化蛋白的HRP標記。其應用于后續WESTERN BLOT、免疫組化、ELISA等。產品即到即用，性能穩定，操作便捷，反應敏感，重復性好。

 

技術背景

 

辣根過氧化酶，分子量44Kd，常作為標記，用于免疫反應的定量檢測（enzyme immunoassay；EIA），例如免疫印跡WESTERN BLOT、免疫檢測ELISA和免疫化學染色immunohistochemical staining等。辣根過氧化酶具有價廉、高純、高特異活性、穩定等優點，成為主要的（占80％）抗體或蛋白綴和標記酶。基于辣根過氧化酶為糖蛋白，含有8個糖鏈，通過高碘酸避光氧化，使羥基和醛基分離后，活化的HRP既不失活，又能在堿性條件下，與所有蛋白或抗體存在的氨基進行偶聯反應，形成席夫堿（Schiff's bases），進而在酸性透析處理后去除剩余的高碘酸和預防自偶聯。經過溫和的硼氫化氰鈉（sodium cyanoborohydride）還原水合作用，以及乙醇胺（ethanolamine）或2-巰基乙胺 （2-mercaptoethylamine）中和殘余的醛基，使標記蛋白/抗體更加穩定。  

 

產品內容

 

緩沖液（Reagent A）   1毫升

標記液（Reagent B）       50微升

還原液（Reagent C）      200微升

中和液（Reagent D）  50微升

保存液（Reagent E）   1毫升

產品說明書       1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里；有效保證6月

 

用戶自備

 

目標抗體或蛋白：用于HRP標記

1.5毫升離心管：用于樣品反應操作和保存的容器

震蕩器：用于混勻反應物

 

實驗步驟

 

• 移取10微升（總量100微克）用戶自備的目標抗體或蛋白（分子量在160Kd左右或以下）
• 加入90微升緩沖液（Reagent A），混勻
• 加入10微升標記液（Reagent B），混勻
• 室溫下（25℃）孵育1小時或4℃冰箱里孵育16小時
• 加入10微升還原液（Reagent C），混勻
• 室溫下孵育15分鐘
• 加入10微升中和液（Reagent D），混勻
• 室溫下孵育15分鐘
• 加入130微升保存液（Reagent E），混勻
• 獲得標記蛋白或抗體終濃度0.6毫克/毫升
• 即刻放進-70℃保存或置于冰槽里備用
• 或繼續后續ELISA、WESTERN BLOT、IMMUNOHISTOLOGY等

 

注意事項

 

• 本產品為5次（100微克/次）操作
• 操作時，須戴手套
• 樣品中避免含有*（sodium azide）、Tris、甘氨酸（glycine）、氫氧化銨（NH4OH）等，否則干擾標記
• 如果標記液（Reagent B）沒有充分溶解，可以放在4℃冰箱里72小時或更長時間后使用
• 如果需要增加標記量，則相應增加試劑用量
• 如果標記500Kd以上的蛋白或抗體，則使用20微升標記液（Reagent B）即可
• 標記效率取決于目標蛋白或抗體與活化HRP的分子摩爾濃度比例和結構關系
• HRP標記蛋白復合體在4℃溫度下保持4周穩定；在－20℃溫度下，保持6個月穩定
• 標記抗體后續應用建議用量如下：

 

應用	標記抗體濃度
ELISA	250納克/毫升至2.5微克/毫升
WESTERN BLOT	0.5微克/毫升至50微克/毫升
IMMUNOHISTOLOGY	2.0微克/毫升至5.0微克/毫升

 

• 本公司提供系列蛋白/抗體標記試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶