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        質粒DNA的提取

        時間:2013-6-3閱讀:516
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        實驗原理
                堿裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們。在pH值介于12.0~12.5這個狹窄的范圍內,線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性,盡管在這樣的條件下,共價閉環質粒DNA的氫鍵會被斷裂,但兩條互補鏈彼此相互盤繞,仍會緊密地結合在一起。當加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復Ph至中性時,共價閉合環狀質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起,因此復性迅速而準確,在而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已*分開,復性就不會那么迅速而準確,它們纏繞形成網狀結構,通過離心,染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。
        實驗材料
        1.葡萄糖 2.三羥甲基氨基甲烷(Tris)
        3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.氫氧化鈉
        5.十二烷基硫酸鈉(SDS) 6.乙酸鉀
        7.冰乙酸 8.氯仿
        9.乙醇 10.胰RNA酶
        11.氨芐* 12.蔗糖
        13.溴酚藍 14.酚
        15.β巰基乙醇 16.鹽酸
        17.含pUC18質粒的大腸桿菌
        實驗步驟
        提取質粒
        1.將2ml含相應抗生素的LB液體培養基加入到試管中,接入含質粒的大腸桿菌,37℃振蕩培養過夜。
        2.取1.5ml培養物倒入微量離心管中,4000rpm,離心2min。
        3.吸去培養液,使細胞沉淀盡可能干燥。
        4.將細菌沉淀懸浮于100μl溶液Ⅰ中,充分混勻,室溫放置10 min。
        5.加200μl溶液Ⅱ(新鮮配制),混勻內容物,將離心管放冰上5 min。
        6.加入150μl溶液Ⅲ(冰上預冷),蓋緊管口,顛倒數次使混勻。
        7.1200rpm,離心15 min,將上清轉至另一離心管中。
        8.向上清中加入等體積酚:氯仿(去蛋白),反復混勻,12000rpm,離心5min,將上清轉移到另一離心管中.
        9.向上清加入2倍體積乙醇,混勻后,室溫放置5-10min。12000rpm離心5min。倒去上清液,把離心管倒扣在吸水紙上,吸干液體。
        10.用1ml70%乙醇洗滌質粒DNA沉淀,振蕩并離心,倒去上清液,真空抽干或空氣中干燥。
        11.加50μl TE緩沖液,其中含有20μg/ml的胰RNA酶,使DNA*溶解,-20℃保存。

         

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