新方法在單分子水平進行電子DNA測序

         DNA測序是醫學和生物學關鍵性發現的推動力。比如，一個人基因組的全部序列為醫學診斷和醫療保健提供重要的標記物和指導方針。盡管過去10年已取得眾多進步，但是當前大多數高通量測序儀器都是依賴于光學技術來檢測DNA的四個結構單元：A、C、G和T。為了進一步提高測量能力，科學家們已開發出電子DNA測序（electronic DNA sequencing）技術來對一組DNA模板進行測序。

zui近，科學家已發現在施加的電流的作用下，DNA能夠穿過蛋白納米孔（protein nanoscale pore）從而在單分子水平上產生電子信號。然而，四個核苷酸堿基在化學結構上非常相似，利用這種技術很難將它們區別開來。因此，研究和開發一種單分子電子DNA測序平臺是一個zui為活躍的研究領域，而且有潛力產生一種手持的DNA測序儀：它能夠破譯基因組從而有助于開展個人化醫學治療和基礎生物醫學研究。

來自美國哥倫比亞大學的一個研究小組（由哥倫比亞大學基因組技術與生物分子工程中心主任、化學工程與藥物學教授Jingyue Ju博士）和來自美國國家標準與技術研究院（National Institute of Standards and Technology, NIST）的研究人員（由美國物理學會成員John Kasianowicz博士）開發出一種能夠區分單個堿基的新方法來潛在地在單分子水平上利用納米孔進行電子DNA測序。相關研究論文于9月21日在線刊登在Scientific Reports期刊上。

在這項研究中，研究人員報道的這種基于納米孔的邊合成邊測序（nanopore-based sequencing by synthesis, Nano-SBS）的策略通過檢測4種不同大小的標記而能夠在單分子水平上準確地區分4種DNA堿基，其中這4種標記是從用于序列測定的5’-磷酸修飾的核苷酸（5'-phosphate-modified nucleotide）上釋放出來的。Nano-SBS策略的基本原理如下所示。在聚合酶鏈式反應（PCR）期間，當每個核苷酸類似物被整合進正在延長的DNA鏈時，由此形成的磷酸二酯鍵讓它所攜帶的標記釋放出來。這些標記物將按照釋放的順序進入納米孔，并根據它們不同的化學結構產生各自*的離子電流阻塞特征（ionic current blockade signature），因而能夠利用電子手段在單分子水平上區分單個堿基并確定DNA序列。為了驗證這個原理，研究人員附著4種不同長度的聚合物標記到2’-脫氧腺苷-5’-四磷酸（2'-deoxyguanosine-5'-tetraphosphate, 即前面所述的5’-磷酸修飾的核苷酸，是一種核苷酸類似物）的末端磷酸基團上，并證實在聚合酶鏈式反應期間，這些核苷酸類似物能夠被有效地整入到DNA鏈中，而且基于它們各自*的納米孔離子電流阻塞特征能夠更好地在單分子水平上對這四種標記進行基準線區分。這種方法與附著到以矩陣形式排布的納米孔的聚合酶結合在一起就應當能夠構建出單分子電子Nano-SBS平臺。

在之前由Ju教授與Nicholas J. Turro博士的一項研究中， 哥倫比亞大學基因組技術與生物分子工程中心利用可裂解的熒光核甘酸可逆性末端終止（cleavable fluorescent nucleotide reversible terminator; nucleotide reversible terminator, NRT）開發出四色邊合成邊測序（four-color DNA sequencing by synthesis; sequencing by synthesis, SBS）平臺。利用可裂解的熒光核甘酸可逆性末端終止（NRT）進行邊合成邊測序（SBS）是一種用于下一代DNA測序系統中的主導方法。

Kasianowicz博士和他的NIST研究團隊開創性地研究了用于單分子分析的納米孔。他們之前報道了不同長度的聚合物（即聚乙二醇, polyethylene glycol, PEG），能夠通過它們在單分子水平上對α-溶血素（α-hemolysin）蛋白納米孔中的電流讀數的*影響而被區別開來。基于此，他們隨后為當前這項研究中的電子DNA測序方法給出理論上的支撐。將SBS概念與*的納米孔可檢測的用來標記DNA結構單元的電子標簽（electronic tag）結合起來就導致研究人員開發出當前這項研究中描述的單分子電子Nano-SBS方法。

正如論文*作者Shiv Kumar博士指出的那樣，“我們的方法新穎之處在于設計和使用4種不同標記的核苷酸，并且這些不同標記的核苷酸一旦被DNA聚合酶整入到DNA鏈上就會釋放4種不同大小的標記，接著當這4種標記通過納米孔時，它們就能夠在單分子水平上被相互區分開來。這種方法就克服了DNA四個堿基之間的小差別所帶來的任何限制，這些限制也是當前大多數納米孔測序方法幾十年來所面臨的挑戰。”再者，這種技術是相當靈活的；利用PEG標記作為原型，人們也能夠選擇其他的化學標記來在不同納米孔系統中提供*的分離。

隨著進一步開發這種Nano-SBS方法，如使用大型蛋白或固態納米孔矩陣，這種系統有潛力準確地、快速地和低成本低地對整個人類基因組進行測序，從而使得它能夠用于常規性醫學診斷。

原文摘要：

PEG-Labeled Nucleotides and Nanopore Detection for Single Molecule DNA Sequencing by Synthesis

We describe a novel single molecule nanopore-based sequencing by synthesis （Nano-SBS） strategy that can accuray distinguish four bases by detecting 4 different sized tags released from 5′-phosphate-modified nucleotides. The basic principle is as follows. As each nucleotide is incorporated into the growing DNA strand during the polymerase reaction, its tag is released and enters a nanopore in release order. This produces a unique ionic current blockade signature due to the tag's distinct chemical structure, thereby determining DNA sequence electronically at single molecule level with single base resolution. As proof of principle, we attached four different length PEG-coumarin tags to the terminal phosphate of 2′-deoxyguanosine-5′-tetraphosphate. We demonstrate efficient, accurate incorporation of the nucleotide analogs during the polymerase reaction, and excellent discrimination among the four tags based on nanopore ionic currents. This approach coupled with polymerase attached to the nanopores in an array format should yield a single-molecule electronic Nano-SBS platform.