PCR引物設計的原則

pcr引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。因此，引物的優劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。 
要設計引物首先要找到DNA序列的保守區。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。如這個區域單鏈能形成二級結構，就要避開它。如這一段不能形成二級結構，那就可以在這一區域設計引物。 
現在可以在這一保守區域里設計一對引物。一般引物長度為15~30堿基，擴增片段長度為100~600堿基對。 
讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%。而且四種堿基的分布隨機。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設計的就不合理。應重新尋找區域設計引物。 

同時引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應多于4個連續堿基的互補。 

引物確定以后，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5′端加酶切位點序列；標記、熒光素、地高等，這對擴增的特異性影響不大。但3′端不能進行任何修飾，因為引物的延伸是從3′端開始的。這里還需提醒的是3′端不要終止于密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發生簡并，會影響擴增的特異性與效率。 

綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設計原則： 

① 引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性。 
② 產物不能形成二級結構。 
③ 引物長度一般在15~30堿基之間。 
④ G+C含量在40%~60%之間。 
⑤ 堿基要隨機分布。 
⑥ 引物自身不能有連續4個堿基的互補。 
⑦ 引物之間不能有連續4個堿基的互補。 
⑧ 引物5′端可以修飾。 
⑨ 引物3′端不可修飾。 
⑩ 引物3′端要避開密碼子的第3位。 

PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設計。 

1.引物的特異性 

引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補堿基同源。 

2.避開產物的二級結構區 

某些引物無效的主要原因是引物重復區DNA二級結構的影響，選擇擴增片段時避開二級結構區域。用有關計算機軟件可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。 

3.長度 

寡核苷酸引物長度為15~30bp，一般為20~27mer。引物的有效長度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因為>38時，zui適延伸溫度會超過Taq DNA聚合酶的zui適溫度（74℃),不能保證產物的特異性