士鋒生物：RNA的制備

一、mRNA的分離 
與rRNA和tRNA不同的是，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的絕大部分mRNA在其3’端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纖維素親和層析法從大量的細(xì)胞RNA中分離mRNA。在構(gòu)建cdna文庫時(shí)， 必須經(jīng)上述純化步驟制備mRNA模板。進(jìn)行Northern雜交或Sl 核酸酶作用圖分析時(shí)，與總RNA相比，采用poly(A)+ RNA能獲得更為滿意的結(jié)果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制備Oligo(dT)－纖維素，也可以買現(xiàn)成的產(chǎn)品。 
1）用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g 0ligo(dT)－纖維素。 
2）將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱或裝入填有經(jīng)用DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴期德吸管中， 柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積滅菌水沖洗柱床。柱床體積為1m的oligo(dT)－纖維素zui大量為10mg總RNA，如果總RNA的量較少，則應(yīng)減少oligo(dT)－纖維素的使用量以防止poly(A)+RNA在過柱以及后續(xù)步驟中損失。 
3）用無菌的1x層析柱加樣緩沖液沖洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x層析柱加樣緩沖液 
20mmol/L Tris.Cl(pH7.6) 
0.5mol/L NaCl 
1mmol/L EDTA(pH8.0) 
0.1％SDS 
可按以下方法制備滅菌的層析柱加樣緩沖液；將適量無rna酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化鈉和EDTA貯存液混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高壓下蒸氣滅菌，待其次序卻至65℃左右時(shí)加入已在65℃預(yù)熱30分鐘的10 ％SDS貯存液。也可以用0.05mol/L檸檬酸鈉代替Tris.Cl 然后用DEPC處理檸檬鈉－NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。 
4）用滅菌水溶解RNA，于65℃溫育5分鐘后使迅速冷卻至室溫，加等體積的2x層析柱加樣緩沖液，上樣，立即用滅菌的試管收集洗液。 當(dāng)所的RNA溶液均進(jìn)入柱床后，加1倍體積的1x層析柱加樣 ，繼續(xù)收集洗出液。加熱RNA可以破壞可能涉及poly(A)尾的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 
5）當(dāng)全部溶液流出后，將收集液置于65℃溫育5分鐘，重新上樣，并收集流出液。 
6）用5-10倍柱床體積的1x層析柱加樣緩沖液洗柱，分部收集洗出液，測(cè)定每一收集管的OD260。zui補(bǔ)由于不帶poly)A)的RNA洗過柱床， OD260會(huì)很高，后來OD260值則很小或?yàn)榱恪Ｔ谀承┓桨钢校鲜霾襟E后還用5倍柱術(shù)體積的含0.1mol/L NaCl的1x 層析柱加樣緩沖液洗柱床，然而由于洗出的不帶poly(A)的RNA很少甚至沒有， 因此這一步驟可以省略。 
7）用2－3倍柱床體積的經(jīng)滅菌且無RNA酶的洗脫緩沖液洗脫mRNA，以1/3－1/2柱床體積分部收集洗脫液。洗脫緩沖液 
10mmol/L Tris.Cl(pH7.6) 
1mmol/L EDTA(pH8.0) 
0.05％SDS