哺乳動物細胞表達系統

按照宿主細胞的類型，可將基因表達系統大致分為原核、酵母、植物、昆蟲和哺乳動物細胞表達系統。與其它系統相比，哺乳動物細胞表達系統的優勢在于能夠指導蛋白質的正確折疊，提供復雜的N型糖基化和準確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達產物在分子結構、理化特性和生物學功能方面zui接近于天然的高等生物蛋白質分子。從zui開始以裸露DNA直接轉染哺乳動物細胞至今的30余年間，哺乳動物細胞表達系統不僅已成為多種基因工程藥物的生產平臺，在新基因的發現、蛋白質的結構和功能研究中亦起了極為重要的作用。本文主要從表達系統及其兩個組成部分——表達載體和宿主細胞等方面，簡要介紹和相關的研究進展。 
研究現狀 
①部分蛋白在哺乳動物細胞中的表達已從實驗室研究邁向生產或中試生產階段。
②已有許多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳動物細胞系統表達和大量制備、生產。如人組織型血纖蛋白酶原激活因子、Ⅷ、干擾素、乙肝表面抗原、紅血球生成激素、人生長激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。有些產品已投入臨床應用或試用。
③雖然經過多年努力，的表達水平有大幅度增高，但從整個水平上看仍偏低，一般處在雜交瘤細胞單克隆抗體蛋白產率的下限，即1-30μg/l08細胞/24小時。有人認為其限速步驟可囂是在工程細胞中(對于重組蛋白來講，常是異源的)，重組蛋白的分泌效率較低。 
1 表達載體 
1．1 表達栽體的類型
哺乳動物細胞表達外源重組蛋白可利用質粒轉染和病毒載體的感染。利用質粒轉染獲得穩定的轉染細胞需幾周甚至幾個月時間，而利用病毒表達系統則可快速感染細胞，在幾天內使外源基因整合到病毒載體中，尤其適用于從大量表達產物中檢測出目的蛋白。
根據進入宿主細胞的方式，可將表達載體分為病毒載體與質粒載體。病毒載體是以病毒顆粒的方式，通過病毒包膜蛋白與宿主細胞膜的相互作用使外源基因進入到細胞內。常用的病毒載體有腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒、semliki森林病毒(sFv)載體等。另外，桿狀病毒載體應用于哺乳動物細胞的表達在近幾年頗受重視，這是因為它與其它病毒載體相比有*優勢，如可通過昆蟲細胞大量制備病毒顆粒；可感染多種哺乳動物細胞，但在細胞內無復制能力，生物安全度高；可插入高達38 kb的外源基因等。
質粒載體則是借助于物理或化學的作用導人細胞內。依據質粒在宿主細胞內是否具有自我復制能力，可將質粒載體分為整合型和附加體型載體兩類。整合型載體無復制能力，需整合于宿主細胞染色體內方能穩定存在，如SV40病毒載體、反轉錄病毒載體和游離型如痘苗病毒、腺病毒載體。利用 Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒載體感染哺乳動物細胞表達的蛋白在結構與功能上與天然哺乳動物來源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒載體感染哺乳動物細胞獲得的外源蛋白占細胞總蛋白的；而附加體型載體則是在細胞內以染色體外可自我復制的附加體形式存在。整合型載體一般是隨機整合入染色體，其外源基因的表達受插入位點 的影響，同時還可能會改變宿主細胞的生長特性。相比之下，附加體型載體不存在這方面的 問題，但載體DNA在復制中容易發生突變或重排。 
附加體型載體在胞內的復制需要兩種病毒成分：病毒DNA的復制起始點(ori)及復制相關蛋白。根據病毒成分的來源不同，附加體型表達載體主要分為4大類，表2對這幾類附加體載體進行了簡要的概括。
載體的選擇取決于外源基因的導人方式和其調控元件是否有利于轉錄和翻譯。真核生物基因高表達載體必須具有如下調控元件：
①原核DNA序列，包括能在大腸桿菌中自身復制的復制子，便于篩選含螢組細菌的抗生素抗性基躅，以及便于目的基因插入的限制性酶切位點。目前采州的哺乳動物細胞表達戟體大都帶有來自pBR322的衍生質粒如pX