細胞中的微絲染色及微絲與細胞形態的觀察實驗

【實驗目的】 
掌握微絲的染色方法，了解光學顯微鏡和電子顯微鏡下微絲的基本形態結構。 
【實驗用品】 
一、材料和標本 蓋片培養的成纖維細胞三片。 
二、器材和儀器 光學顯微鏡一臺、鑷子一把、小平皿六個、載片三個、吸水紙、37℃恒溫箱。 
三、試劑 PBS(pH7.2)、2％Triton X—100液、M—緩沖液、3％戊二醛固定液、0.2％考馬斯亮蘭染液、100μg／ml的細胞松馳素B、Dmem培養液。 
【實驗內容】 
一、成纖維細胞微絲的染色及其對細胞松馳素B的反應 
(一)原理 
微絲普遍存在于多種細胞，對細胞的形狀和運動有一定作用。細胞松馳素B可與微絲的亞單位肌動蛋白結合，從而破壞微絲，改變細胞的形狀。 
(二)細胞松馳素B處理成纖維細胞與染色觀察 
1．在平皿中有三張成纖維細胞貼壁生長的蓋片，在超凈工作臺內將一張蓋片移入另一皿中繼續培養，用作對照。 
2．在有兩片的平皿內加100μg／ml的細胞松弛素B 4滴繼續培養半小時。 
3. 將用細胞松弛素B處理過的兩張蓋片取一張做染色處理，另一張用培養液洗五次（在平皿內換五次培養液，每次都要搖動），繼續培養、觀察。兩小時后細胞形狀恢復，接近正常。 
4．對恢復的蓋片與*張沒用藥的蓋片一同做染色處理。 
5．染色處理 
①將需染色的蓋片放入盛有PBS的平皿內用吸管輕輕吹洗蓋片，換液三次，每次3分鐘，洗去培養液。 
②將蓋片移入2％Triton X一100液，置37℃恒溫箱內處理20～30分鐘，以提取骨架以外的蛋白質，使骨架圖像清晰。 
③立刻將蓋片移入M一緩沖液，換洗三次，每次3分鐘。M一緩沖液有穩定細胞骨架的作用。 
④將蓋片移入3％戊二醛固定15分鐘。 
⑤將蓋片移入0.2％考馬斯亮蘭染液中，染色15分鐘。然后小心地用自來水沖洗，空氣干燥。 
(三)結果 
光鏡觀察，微絲聚集成的張力纖維束被染成藍色。在沒用藥的標本上，成纖維細胞多數有突起，微絲沿突起規則排列；用細胞松馳素B處理的標本，由于微絲被破壞突起縮回，多數細胞形狀變圓；用藥處理后又洗去藥的標本，由于解除了藥的作用，肌動蛋白重新聚臺形成微絲，細胞形狀恢復正常。 
二、麗藻細胞內胞質環流及其對細胞松弛素B的反應 
(一)原理 
麗藻細胞大，整個細胞的為大液泡占據。靠近液泡是一層溶膠樣流動的內質，在內質與質膜之間，為靜止的外質，其中含有葉綠體。內質中含有許多顆粒，可以清楚地看到胞質環流。在麗藻細胞中的微絲與胞質環流有密切關系。成束的微絲出現在外質與內質接口(溶膠和凝膠接口)并交織一起，與環流方向平行。用細胞松弛素B處理后，就可抑制胞質的環流運動。 
(二)方法 
1．剪下一小塊麗藻葉片(1～2cm)，置于載片上，蓋上蓋片。 
2．觀察（陽光充足時效果較好）。 
3．再取一塊麗藻葉片，滴一滴細胞松弛素B，10~15分鐘后蓋上蓋片，觀察。 
4．洗去藥物，再觀察。 
(三)結果 
在麗藻內質中可以看到胞質環流，用細胞松弛素B處理后，胞質環流停止，洗去藥物，又出現胞質環流。 
三、微絲的電鏡照片觀察 
恒河猴脊髓內神經纖維中微絲電鏡照片，可見微絲是實心結構，直徑5～8cm，它均勻地分散于細胞基質中，或排列成束和網狀。