分子標記的種類及其發展

廣義的分子標記(molecular marker)是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質。蛋白質標記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個以上基因位點編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。狹義的分子標記概念只是指DNA標記，而這個界定現在被廣泛采納。本文中也將分子標記概念限定在DNA標記范疇。

1.2 理想的分子標記的界定

理想的分子標記必須達到以下幾個要求：(1)具有高的多態性；(2)共顯性遺傳，即利用分子標記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型；(3)能明確辨別等位基因；(4)遍布整個基因組；(5)除特殊位點的標記外，要求分子標記均勻分布于整個基因組；(6)選擇中性（即無基因多效性）；(7)檢測手段簡單、快速（如實驗程序易自動化）；(8)開發成本和使用成本盡量低廉；(9)在實驗室內和實驗室間重復性好（便于數據交換）。

但是，目前發現的任何一種分子標記均不能滿足以上所有要求。

2 分子標記的種類

2.1 限制性片段長度多態性

2.1.1 限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，縮寫RFLP)是發展zui早的分子標記技術。RFLP技術的原理是檢測DNA在限制性內切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位點變異的突變如點突變（新產生和去除酶切位點）和一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點間的長度發生變化）等均可導致RFLP的產生。此技術及其從中發展出來的一些變型均包括以下基本步驟：DNA的提取、用限制性內切酶酶切DNA、用凝膠電泳分開DNA片段、把DNA片段轉移到濾膜上、利用放射性標記的探針顯示特定的DNA片段（通過southern雜交）、分析結果。由于線粒體和葉綠體DNA較小，前三個步驟就*可能檢測出DNA片段的差異，所以往往不必要后面的幾個步驟；對線粒體和葉綠體DNA進行的這種多態性差異檢測在1980年之前就已出現，從理論上說，這種多態性也可稱為RFLP。

2.1.2 一般選擇單拷貝探針。但如果RFLP探針是來自拷貝數可變串聯重復（Varible number of tandem repeats，縮寫VNTR），則產生另一類因相同或相近序列的拷貝數變化所引起的多態性。凡是引起重復單位的大小和序列不同、基因組中重復的數目和分布不同等均可導致這種多態性的產生。在RFLP技術中有特殊用途（成為分子標記）的重復序列包括：(1) 小衛星(minisalite)序列：重復單位(motif)約有堿基10－60個（也有16－100個堿基一說），在基因組中多次出現。(2) 微衛星(microsalite)或簡單重復序列(simple sequence repeats，縮寫SSR)：重復單位含有1-5個堿基（也有2-8個堿基一說）(microsalite一詞由Litt & Luty(1989) 〔11〕提出)。

2.2以PCR(聚合酶鏈式反應)為基礎的分子標記

2.2.1 隨機擴增多態性DNA(random amplified polymorphic DNA，縮寫RAPD)：

2.2.1.1基本原理和特點：該技術用一個（有時用兩個）隨機引物（一般8－10個堿基）非定點地擴增DNA片段，然后用凝膠電泳分開擴增片段。其特點包括：(1)不需DNA探針，設計引物也不需要知道序列信息；(2)用一個引物就可擴增出許多片段（一般一個引物可擴增6－12條片段，但對某些材料可能不能產生擴增產物），總的來說RAPD在檢測多態性時是一種相當快速的方法；(3)技術簡單，RAPD分析不涉及Southern雜交、放射自顯影或其它技術；(4)不象RFLP分析，RAPD分析只需少量DNA樣品；(5)成本較低，因為隨機引物可在公司買到，其價格不高；(6)RAPD標記一般是顯性遺傳（極少數是共顯性遺傳的），這樣對擴增產物的記錄就可記為“有/無”，但這也意味著不能鑒別雜合子和純合子；(8)RAPD分析中存在的zui大問題是重復性不太高，因為在PCR反應中條件的變化會引起一些擴增產物的改變；但是，如果把條件標準化，還是可以獲得重復結果的〔12〕;(9)由于存在共遷移問題，在不同個體中出現相同分子量的帶后，并不能保證這些個體擁有同一條（同源）的片段；同時，在膠上看見的一條帶也有可能包含了不同的擴增產物，因為所用的凝膠電泳類型（一般是瓊脂糖凝膠電泳）只能分開不同大小的片段，而不能分開有不同堿基序列但有相同大小的片段。