引物設計原則

1. 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq dna聚合酶進行反應。
2. 引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現3個以上的連續堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發機率增加。
3. 引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。
4. 引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物所對應模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復性條件。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在oligo軟件中使用的是zui鄰近法(the nearest neighbor method)。
6. ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性。應當選用3’端ΔG值較低（值不超過9），而5’端和中間ΔG值相對較高的引物。引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應。
7. 引物二聚體及發夾結構的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。
8. 對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR產物的載體的相應序列而確定。

引物序列應該都是寫成5-3方向的，
Tm之間的差異控制在1度之內，
另外我覺得擴增長度大一些比較好，500bp左右。
要設計引物首先要找到DNA序列的保守區。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。如這個區域單鏈能形成二級結構，就要避開它。如這一段不能形成二級結構，那就可以在這一區域設計引物。
① 引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性。 ② 產物不能形成二級結構。 ③ 引物長度一般在15~30堿基之間。 ④ G+C含量在40%~60%之間。 ⑤ 堿基要隨機分布。 ⑥ 引物自身不能有連續4個堿基的互補。 ⑦ 引物之間不能有連續4個堿基的互補。 ⑧ 引物5′端可以修飾。 ⑨ 引物3′端不可修飾。 ⑩ 引物3′端要避開密碼子的第3位。

1.引物的特異性 引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補堿基同源。 
2.避開產物的二級結構區 某些引物無效的主要原因是引物重復區DNA二級結構的影響，選擇擴增片段時避開二級結構區域。用有關計算機軟件可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。 
3.長度 寡核苷酸引物長度為15~30bp，一般為20~27mer。引物的有效長度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因為>38時，zui適延伸溫度會超過Taq DNA聚合酶的zui適溫度（74℃),不能保證產物的特異性。 
4.G+C含量 G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值接近72℃以使復性條件。 
5.堿基礎隨機分布 引物中四種堿基的分布是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區錯誤引發。
6.引物自身 引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾狀結構牙引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續互補堿基不能大于3bp。 7.引物之間 兩引物之間不應不互補性，尤應避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應多于4個連續堿基的同源性或互補性。 8.引物的3′端 引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結構可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應中，引物3′端不能發生錯配。 在標準PCR反應體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四種dNTP各200μmol/L）以質粒（103拷貝）為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循環參數擴增HIV-1 gag基因區的條件下，引物3′端錯配對擴增產物的影響是有一定規律的。A∶A錯配使產量下降至1/20，A∶G和C∶C錯七下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯配對PCR影響是等同的。 9.引物的5′端 引物的5′端限定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標記、熒光、、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。 10.密碼子的簡并 如擴增編碼區域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡并，會影響擴增特異性與效率。
Hairpin 發卡結構
如果自由能值大于0 則該結構不穩定從而不會干擾反應如果自由能值小于0 則該結構可以干擾反應
二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向。引物之間形成如果配對區域在3 末端問題會更為嚴重3 末端配對很容易引起引物二聚
體擴增使
Pair Rating 匹配度評分匹配度低的引物對常常不太有效是因為在同樣退火溫度下Tm低的引物決定擴增的特異性而Tm高的引物更易于形成非特異性結合而造成錯誤的起始
【1】引物的長度以15－30bp為宜，否則會影響擴增的特異性。
【2】 】堿基盡可能隨機分布，避免相同的堿基成串排列，引物的G+C含量在40％－60％之間，若G+C含量太低，可在5"端加上一些G或C，若G＋C含量太高，可在5"端加上一些A或T。
【3】 應避免每條引物內部形成二級結構及兩條引物的3"端互補形成引物二聚體，避免在引物的3"端有3個G或3個C成串排列，3"端的末位堿基選T、C、G,而不選A，也有建議在引物的兩端用1－2個嘌呤堿基。
【4】 盡可能使用兩條引物的Tm值相同（相差不要超過5℃），退火溫度根據較低的Tm值選定，也可以通過改變引物的長度來平衡兩條引物的退火溫度。Tm值可以根據Tm=4(G+C)+2(A+T)計算。而對于較長的引物，Tm值需要考慮動力學參數、從“zui近鄰位”的計算方式得到，現有的PCR引物設計軟件大多數都采用這種方式。（注：對于Tm值的計算有爭議的地方是附加序列應不應該計算在內，我覺得有值得商討的地方。因為從理論上只有zui開始的循環引物的附加序列是不與模板鏈結合的，而在后來的PCR反應中，引物的附加序列是和模板鏈結合了的。）
【5】 引物的3’端要與模板嚴格配對，而5’端堿基沒有嚴格的限制，只要與模板DNA結合的部分足夠長，其5’端堿基可不與模板DNA配對而呈游離狀態，這樣，我們可以在引物的5末端加上酶切位點（引入酶切位點時，要考慮到進行雙酶切的共用緩沖液，否則給下游工作帶來困難）、啟動子，方便下游操作。
【6】 不要在擴增序列的二級結構區設計引物，以免退火困難。也要考慮引物設計處模板的特異性。