RAPD技術應用中的一些問題及對策

摘要：綜述了RAPD技術的一些理論性問題，包括RAPD與其它分子標記技術相比的優點，影響結果重復性的因素，顯性標記產生的原因，條帶取舍的標準等。提出在實驗中解決這些問題的一些方法：嚴格控制反應條件，采用單倍體和單劑量標記，系統學研究中要結合其它方法進行分析，定位基因時要選用合適的群體等。

1.RAPD技術原理及特點

1．1原理RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA），即隨機擴增多態性DNA技術，是由美國科學家Wiliams和Welsh于1990年分別研究提出的，又稱任意引物PCR。它的應用是基于這樣的一個推理：對于同一模板DNA，用同一引物擴增既可能得到相同的帶譜（模板基因組間可能具有同源性），也可能得到不同的帶譜。僅在某一特定模板中出現的條帶就可作為該模板的分子標記。事實上，不同基因組DNA總是一定差異的，所以用RAPD就可以進行分子標記研究。理論上講，在一定的擴增條件下，擴增的條帶數取決于基因組的復雜性。對特定的引物，復雜性越高的基因組所產生的擴增條帶數也越多。

90年代前期RAPD技術得到廣泛的應用，幾乎所有的作物都有這方面的研究報告。但隨著研究的深入，人們發現該技術存在一定的缺陷，并對此作了一些探索。本文僅就RAPD技術的原理和應用中存在的理論性問題及一些改進措施的研究作一綜述。

1.2RPAD特點與PCR相比，具有以下幾個特點：

與RFLP相比，具有以下特點：
①RAPD分析只需要少量模板，一次擴增僅需20－100ng，這對于DNA量很少的材料進行基因組分析有利。比如對花粉粒、原生質體、種子等的DNA分析是切實可行的。
②RAPD標記具有更大的隨機性，亦有利于圖譜的構建。對于DNA含量大的和多倍體物種，RFLP探針會與多倍體的多個片段雜交，所得到的混合指紋會對其它等位基因的闡明帶來困難。而且由于DNA量較大，進行單拷貝的southern雜交不很實際，至少需要很長的曝光時間，并且已知的探針數量有限。RAPD大大增加了可構建遺傳圖譜物種的數量。
③無需借助于有傷害性的同位素，耗費的人力物力少。
④靈敏度高。引物中的個別堿基的變化會引起擴增條帶和強度的劇烈變化，這是RFLP所*的。
⑤RAPD標記可以覆蓋整個基因組，包括編碼和非編碼區，可以反映整個基因組的變化。
⑥RAPD產物有大于50％的條帶擴增于單拷貝區，經過克隆和序列分析后，可作為RFLP和原位雜交的探針，在基因定位、克隆及輔助選擇育種中可以廣泛應用。

2.RAPD技術本身存在的問題及對策

RAPD技術是由多種成分參加的生化反應，反應中各種成分均為微量，盡管其反應靈敏度高，但是影響因素較多，會出現重復性差等一些問題。為了得到較穩定的結果，各種反應參數必須事先優化選擇，操作中每一步都必須小心謹慎，以防止出現差錯。

2．1溫度RAPD一般反應條件是：變性92－95℃，常用94℃，30－60s；延伸72℃，60－120s；退火35－37℃，30－60s。變性和延伸溫度一般沒有太大變化，而退火溫度影響較大。退火溫度低，引物和模板結合特異性較差，出現的條帶可能增多；退火溫度高，引物和模板結合特異性增加。有人提出，在尋找基因差異為目的的實驗中，退火采用33－34℃效果更好。在優化方案中，退火溫度可能要提高，以便降低背景，得到少而清晰的＂帶＂。溫度的梯度率也是十分重要的，特別是退火與延伸之間的梯度尤為重要。各種儀器的控溫、升降溫性能均有差別，一些儀器（如一些舊型號的儀器）在到達特定的溫度前就開始計時，一些PCR儀顯示的溫度與實際溫度會有差異。這些在設計程序和結果分析時有必要考慮，所以注明所用儀器的生產廠家、品牌、規格，就顯得很有必要，對于同一批實驗，注意控制在同樣的溫度條件下進行反應，結果才有可比性。