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當前位置：上海士鋒生物科技有限公司>>公司動態>>重組DNA的轉化實驗
實驗目的
制備出感受態細胞，把體外重組的DNA引入受體細胞，使受體菌具有新遺傳性，并從中選擇出轉化子。
實驗原理
感受態就是細菌吸收轉化因子的生理狀態，只有發展為感受態的細胞才能穩定攝取外來的DNA分子。pUC18的LacZ基因區域當有dna片段插入時，LacZ基因失活，轉化進入大腸桿菌并在含有IPTG和X-gal培養基生長時，會產生白色的克隆，不含插入片段的pUC18質粒進入宿主細胞生成藍色菌落。
實驗操作
（一）受體菌的培養與CaCl2處理（無菌操作）
1、取0.3ml種子液接到裝有30 ml LB液體培養基的三用瓶中，振蕩培養2-2.5小時
2、取出一定量菌液置于冰浴10分鐘
3、4,000rpm，4℃離心5分鐘，收集菌體
4、把菌體懸浮在4 ml 100mM冷CaCl2中，冰浴25分鐘。
5、5,000rpm，4℃離心5分鐘，收集菌體
6、再把菌體懸浮在1ml 100 mM冷CaCl2中置4 ℃ 12-24小時，備用。
（二）倒皿鋪平板
1、按照各組轉化反應的混合物
控制不同的選擇性培養基(20 ml/皿)
LB固體培養基(100 ml)+Amp（60μg/ml）+Tet(40μg/ml)供連接混合物轉化，pUC18轉化用, 共5皿
LB固體培養基 (100 ml)+Amp (60μg/ml)+X-gal (40μg/ml)+IPTG(24μg/ml),供連接混合物轉化，pUC18轉化用,共5皿
2、轉化反應前一天，先鋪好平板
3、取各組反應物在平板上涂布
4、培養皿倒置于37℃培養箱中過夜
5、觀察轉化子出現的情況
(三) 轉化反應
待轉化DNA的準備
我們需將連接混合物，提取的pUC18兩種樣品作轉化反應，按下表準備
取上述兩組混合物在Eppendorf管中，按如下處理：
1、將各組Eppendorf管置冰浴/小時以上
2、把上述樣品置42℃水浴中，2分鐘
3、轉移到37℃水浴中5分鐘，加800μl LB液體培養基
4、在37℃搖床上振蕩培養1小時，取25μl涂皿
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