DNA的限制性內(nèi)切酶酶切

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?nbsp;
1. 學(xué)會DNA限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù)。 
2. 瓊脂糖凝膠電泳法觀察酶切DNA的結(jié)果。 

實(shí)驗(yàn)原理 
質(zhì)粒pUC118上有限制性內(nèi)切酶BamHI的識別序列G↓GATCC，用BamHI酶切后形成線性質(zhì)粒dna。瓊脂糖凝膠電泳可以按酶切產(chǎn)物分子量的大小分離DNA片段，小片段比大片段遷移快，凝膠上遷移的距離與分子量的對數(shù)成反比。要準(zhǔn)確地確定DNA片段的大小，必須用分子量標(biāo)準(zhǔn)物同時(shí)進(jìn)行電泳對照。常用的分子量標(biāo)準(zhǔn)是lDNA/EcoRI、lDNA/HindIII、lDNA/EcoRI+HindIII的酶切片段
DNA的限制性內(nèi)切酶酶切
DNA的限制性內(nèi)切酶酶切
實(shí)驗(yàn)材料和試劑 
（一）實(shí)驗(yàn)材料 
實(shí)驗(yàn)二提取的質(zhì)粒pUC118??? 
（二）試劑 
1．限制性內(nèi)切酶BamHI 
2．l DNA/HindIII分子量標(biāo)準(zhǔn) 
3．雙蒸餾無菌水 
4．溴酚藍(lán)指示劑點(diǎn)樣緩沖液 
5．1mg/ml溴化乙錠溶液 
6．電泳緩沖液（TAE） 
7．0.7% 瓊脂糖凝膠（用TAE電泳緩沖液配制） 

（三）器材 
1.5ml Eppendorf管 200ml吸頭 
（四）儀器 
微量移液器 離心機(jī) 
恒溫水浴鍋 電泳儀 
水平電泳槽 透射紫外觀察儀

實(shí)驗(yàn)步驟 
1. 取一個(gè)滅菌的Eppendorf管，依次加入下列試劑： 
雙蒸餾無菌水 12ml 
10×BamHI緩沖液 2ml 
質(zhì)粒pUC118 5ml 

BamHI 1ml 
總體積 20ml 
2. 用手指輕彈管壁，使各種試劑混勻，快速離心，以集中溶液。 
3. 置37℃水浴60～120 分鐘。 
4. 加入5ml溴酚藍(lán)指示劑點(diǎn)樣緩沖液，按實(shí)驗(yàn)三方法電泳，觀察酶切反應(yīng)結(jié)果，鑒定酶切效果。

【提示】
實(shí)驗(yàn)操作中注意的問題
1. 酶切反應(yīng)用的Eppendorf管和吸頭，都要用新的，用雙蒸餾水洗凈，滅菌。使用前打開包裝，用鑷子夾取，不要直接用手去拿，以防手上的雜酶污染。
2．DNA樣品和限制性內(nèi)切酶的用量都極少，必須嚴(yán)格注意吸樣量的準(zhǔn)確性及全部放入反應(yīng)體系中。
3．要注意酶切加樣的次序，一般次序?yàn)殡p蒸餾無菌水、緩沖液、DNA各項(xiàng)試劑，zui后才加酶。
4．取酶時(shí)，吸頭要從酶液的表面吸取，以防止吸頭沾上過多的酶液。待用的酶要放在冰浴內(nèi)，用后蓋緊蓋子，立即放回-20℃冰箱中，防止酶失活。
5．當(dāng)樣品在37℃保溫時(shí)，要將Eppendorf管的蓋子蓋緊，防止因蓋子未蓋嚴(yán)密使水進(jìn)入管內(nèi)，造成實(shí)驗(yàn)失敗。