隨機引物PCR技術(shù)

．實驗原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction）簡稱PCR，它是一種DNA體外擴增技術(shù)。1985年美國的Mullis等人發(fā)明了PCR技術(shù)，在體外利用模板DNA 、特定的寡聚核苷酸引物和DNA聚合酶，通過DNA變性、復(fù)性和延伸過程合成一條互補的DNA鏈。反復(fù)重復(fù)這一過程，模板DNA就可得到大量擴增。在PCR過程中，DNA的延伸起初是用大腸桿菌的DNA聚合酶I（Klenow片段）來完成的。由于大腸桿菌的聚合酶不耐熱，每次加熱變性DNA后都要補加新的聚合酶。這不僅增加了實驗成本，而且當(dāng)同時擴增多個樣品時極易出錯。在耐熱DNA聚合酶（Taq酶）發(fā)現(xiàn)后，才使PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用成為可能。特別是自動熱循環(huán)儀（又叫DNA擴增儀）的發(fā)明，使PCR反應(yīng)過程可以電腦控制，實現(xiàn)了自動化。PCR技術(shù)的發(fā)明雖然只有10多年的時間，但目前這一技術(shù)及其衍生的其他實驗技術(shù)在生物學(xué)的許多領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用。

隨機引物PCR（Arbitrary - primer PCR，縮寫為AP-PCR）又稱隨機擴增多態(tài)性DNA（Random amplified polimophic DNA，縮寫為RAPD），是Williams和Welsh等1990年在PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種實驗技術(shù)。在RAPD擴增中，僅用一個8-10堿基的寡核苷酸引物，引物的序列是隨機的。RAPD反應(yīng)的條件與普通PCR基本相同。但由于引物較短，一般退火所需溫度較低。RAPD與普通PCR的另一個明顯的不同是前者不需知道模板DNA的序列，擴增出來的片段也是非特異性的；而后者則必須知道待擴增目的片段的序列，根據(jù)這一序列設(shè)計一對相應(yīng)的引物。

RAPD技術(shù)一出現(xiàn)，便以它的簡便、快捷和多態(tài)性撿出率高而引起科學(xué)工作者的興趣。目前這一技術(shù)已被廣泛用于遺傳圖譜構(gòu)建、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、DNA指紋分析和基因定位等不同研究領(lǐng)域。

二．實驗步驟

（1）在0.5ml無菌離心管中依次加入下列溶液（在超凈臺上操作），加入后輕輕混勻。

無菌水 13μl

10×擴增緩沖液 2.5μl

4dNTPs溶液 1.5μl

引物 2.5μl

植物DNA（5ng/μl） 5μl

--------------------------- Taq DNA聚合酶 0.5μl

總體積 25μl

（2）加入100μl礦物油，遮蓋反應(yīng)混合液的表面。

（3）將試管轉(zhuǎn)入DNA擴增儀，按下列條件進(jìn)行擴增循環(huán)（需預(yù)先調(diào)節(jié)），共進(jìn)行45個循環(huán)：

變性 復(fù)性 聚合反應(yīng)

94°C ，1分 35°C，1分 72°C，2分

（4）循環(huán)完成后，在72°C再延伸6分鐘。

（5）將反應(yīng)產(chǎn)物在1.4%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察擴增的DNA條帶。