mRNA差異PCR技術

生物界的豐富多彩很大程度上取決于嚴格調控下的基因的選擇性表達。高等生物的細胞內約含有105個不同的基因，而主 基因在某個特定的細胞中，只有占15％的一小部分表達。而且在不同的細胞中，選擇性表達的基礎也是不同的。正是這些基因的選擇不同決定了整個生命的過程：如細胞的生長分化，激素和細胞困子對細胞的作用、細胞周期的調控以及衰老、死亡等。和細胞的正常生理一樣，一些病理的反應如腫瘤等也是由基因表達的改變引起的。所以，這種基因的選擇性表達，是細胞生物學要研究的核心問題之一，而對于這一問題的研究方法也是分析生物發育和調控機制的一種重要方法。
以往，研究基因表達差異的主要方法是雙向蛋白質電泳指紋圖譜和依賴雜交的篩選技術。這兩種技術各有自己的適用范圍和優點。蛋白質指紋技術具有很高的靈敏度，可以很方便地區分出不同的表達產物，但往往得不到足夠的量來分析和克隆它們的基因；而雜交技術則需要較長的周期和繁瑣的步驟，也易發生基因的丟失。所以多年以來，人們一直想找出一種更方便有效的替代方法。

哈佛大學醫學院的Ｐeng Ｌiang和Ａrthur Ｂ．Ｐardee博士發明的mＲＮＡ差別顯示即ＤＤ法（differential display of mＲＮＡ by ＰＣＲ）， 是一種新的研究基因差異表達的有力工具。這個方法的離要程序是將細胞內的m ＲＮＡ抽提出來，反復錄成cＤＮＡ，爾后經ＰＣＲ隨機擴增， 通過在測序凝膠上電泳條帶的比較篩選出不同的表達的基因，并回收這些ＤＮＡ片段，經擴增后作為探針，在c ＤＮＡ或基因組ＤＮＡ庫中掃描找到相關基因。原則上如果選用不同的引物組合，這個方法可以檢測到細胞中約15000種不同基因的表達情況， 這就給出了一個類似于蛋雙向電泳的指紋圖譜，基因表達的不同馬上就可以知道，并因此分離到該基因。

由于這種方法主要依賴于ＰＣＲ技術，所以選擇合知的引物是這一方法成功的關鏈。用于逆轉錄合成單鏈cＤＮＡ和ＰＣＲ擴增的３"引物設計得益于許多真m ＲＮＡ共有的polyＡ尾巴，所以oligo dＴ作引物就可錨定在polyＡ上。 加之又在引物的３"端加了兩個堿基，它們將隨機地與mＲＮＡ的polyＡ上游兩個堿基配對，由于這兩個堿基有12種不同的組合，從而將有的mＲＮＡ分成12個組。 這樣就減少了每次分析的mＲＮＡ數量，提高了分辨率。后來這一引物的設計又得到了改進， 將倒數第二個堿基改成了一個簡并堿基，從而將３"引物的數量減少到４個， 分別是５"Ｔ12ＮＡ３"、５"12ＮＧ３"、５"Ｔ12ＮＴ３"和５"12ＮＣ３"（其中Ｎ是d Ａ、dＧ或dＣ），這樣就將所有mＲＮＡ分成了４組， 這一改進既減少了引物的用量和需要分析的次數，又保證了足以靈敏地檢測到所有可能的表達產物。

在獲得cＤＮＡ以后進行的ＰＣＲ擴增中，５"所用的引物是一組隨機引物，引物的選擇關鍵在于它們的長度。理論上這個長度要滿足兩個條件：一是要和m ＲＮＡ有合適的配對效率，其次則是必須符合ＰＣＲ引物的要求。從為了獲得較高的配對概率來講，這個引物應足夠短，以具有更高的靈敏度，６到７個堿基被認為是合適的長度。但是很明顯，這樣一個引物用于ＰＣＲ擴增是太短的，雖說在用ＰＣＲ研究 ＤＮＡ多態性的實驗中，8￣10個堿基長的引物也被應用，但一般ＰＣＲ所用的上物往往有20個堿基或更長。經過選擇不同長度引物是適宜的，下表是實驗的結果：

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隨相引物的長度 配對幾率 陳列的mＲＮＡ數

（個）

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（堿基數） （千堿基/配對位點） 理論值 實際結果