士鋒生物蛋白定量Commassie法和BCA法比較

蛋白測定是在生命科學研究中zui廣泛應用的方法之一。在蛋白提純，電泳，免疫分析，細胞生物，分子生物和其他研究應用時評估蛋白濃度是必需的。雖然目前有各種不同的蛋白測定方法，但仍然還沒有一種測定方法被認為是廣泛適合于所有的應用要求。每種方法都有它的優點和限制。一般來說，研究中經常需要用到一種以上的蛋白測定方法以排除一些未知的物質的干擾。

大多數蛋白樣品可通過比色測定法定量。在典型的蛋白測定中，化學試劑加入到蛋白樣品溶液里產生顏色變化，這一變化可由分光光度計或酶標儀檢測，并與已知濃度的蛋白標準曲線作比較。博士德為大家提供兩種蛋白測定手段，每種都有其*的優點。如果樣品數量較多，可以同時使用兩種測定用酶標儀自動檢測。當你選擇一種蛋白測定方法時需要考慮兩個因素：緩沖液的化學組成和檢測的蛋白量。

Commassie法（Bradford法）：

原理：在酸性條件，蛋白質與考馬斯染料G-250結合，顏色從棕色變為藍色，在595nm處檢測吸光值然后與標準曲線對比，即可計算出待測蛋白的濃度。

BCA法：

原理：在堿性條件下，蛋白將Cu++還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫色絡合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。

現對這兩種方法進行比較：

一、實驗材料：

細胞總蛋白提取試劑盒（AR0103）

M231

BCA蛋白定量試劑盒（AR0146）

Commassie改良增強型蛋白質定量試劑盒（AR0145）

二、操作步驟：

Commassie法：

1.將BSA凍干標準品（10mg/支）用生理鹽水或PBS稀釋成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八個濃度的蛋白標準溶液。

2.M231用細胞總蛋白提取試劑提取總蛋白。

3.各取20ul蛋白標準品和待測M231樣品至相應標記的微孔板中。

4.滴加200ul考馬斯增強型試劑（溶液A）至每孔混勻并充分震蕩30S

5.停止震蕩，在室溫孵育樣品10min

6.在酶標儀中測量595nm時的吸光值。

7.繪制標準曲線，再用標準曲線判斷出樣品的蛋白濃度。

BCA法：

1.按50體積BCA試劑A加入1倍體積BCA試劑B配置適量BCA工作液，充分混勻。

2.將BSA凍干標準品（10mg/支）用生理鹽水或PBS稀釋成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八個濃度的蛋白標準溶液。

3.M231用細胞總蛋白提取試劑提取總蛋白。

4.各取20ul蛋白標準品和待測M231樣品至相應標記的微孔板中。

5.滴加200ulBCA工作液至每孔混勻并充分震蕩30S

6.停止震蕩，在37度孵育樣品30min

7.在酶標儀中測量562nm時的吸光值。

8.繪制標準曲線，再用標準曲線判斷出樣品的蛋白濃度。

三、實驗結果

 
其中1到8為2000ug/ml，1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625的標準濃度的BSA蛋白，9為空白孔，樣品1為8倍稀釋M231總蛋白，樣品2為32倍稀釋M231總蛋白

Commassie法： 

為了測試準確，應在試劑加入后的5～20min內測定光吸收，因為在這段時間內顏色是zui穩定的。 由標準曲線可以算出樣品原始濃度為14.4mg/ml

Commassie法優點是：

1.靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其zui低蛋白質檢測量可達1ug。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大，蛋白質－染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。

2.測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性。

3.干擾物質少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。

此法的缺點是：

1.由于各種蛋白質中的和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用g—球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。

2. 仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1M的NaOH。（如同0.1M的酸干擾Lowary法一樣）。

3. 標準曲線也有輕微的非線性，在0-1000ug/ml濃度范圍內有較好線性。因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。
BCA法： 

由標準曲線可以算出樣品原始濃度為14.28mg/ml

BCA法特點：    1. 靈敏度高，檢測濃度下限達到25μg/ml，zui小檢測蛋白量達到0.5μg，待測樣品體積為1-20μl 。    2. 測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的去污劑等化學物質的影響，可以兼容樣品中高達5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。    3. 在20-2000μg/ml濃度范圍內有良好的線性關系。    4. 檢測不同蛋白質分子的變異系數遠小于考馬斯亮藍法蛋白定量。  5. 受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巰基乙醇低于1mM

BCA法和Commassie法各有優勢，在不知道蛋白樣本緩沖液成分的情況下可以兩種方法配合使用，以消除定量的誤差。