細胞技術(shù)及活力測定

一、原理

培養(yǎng)的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數(shù)。計數(shù)結(jié)果以每毫升細胞數(shù)表示。細胞計數(shù)的原理和方法與血細胞計數(shù)相同。

在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。

用臺盼蘭染細胞，死細胞著色，活細胞不著色，從而可以區(qū)分死細胞與活細胞。利用細胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測定細胞相對數(shù)和相對活力。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計數(shù)板、試管、吸管、酶標(biāo)儀（或分光光度計）

2、試劑：0.4%臺盼蘭，0.5%四甲基偶氮唑鹽（MTT）、酸化異丙醇

3、材料：細胞懸液

三、操作步驟

（一）細胞計數(shù)

1、將血球計數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。

2、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：

細胞數(shù)/ml=4大格細胞總數(shù)/ 4×10000

注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。

（二）細胞活力

1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中。

2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。

3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù)，計細胞活力。

死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

活力測定可以和細胞計數(shù)合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。

（三）MTT法測細胞相對數(shù)和相對活力

活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細胞內(nèi)和細胞周圍。其量與細胞數(shù)呈正比，也與細胞活力呈正比。

1、細胞懸液以1000rpm離心10分鐘，棄上清液。

2、沉淀加入0.5-1ml MTT,吹打成懸液。

3、37℃下保溫2小時。

4、加入4-5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻。

5、1000 rpm離心，取上清液酶標(biāo)儀或分光光度計570nm比色，酸化異丙醇調(diào)零點。

注意：MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細胞數(shù)。

附：1、0.4%臺盼蘭染液配制：

臺盼蘭 0.4克 加雙蒸水至100 ml.

2、MTT配制：

MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液或無酚紅的基礎(chǔ)液中。4℃下保存。

3、酸化異丙醇配制：

異丙醇中加入HCl使zui終達0.04mol/L。