士鋒生物內切酶的特性、酶解與瓊脂糖凝膠電泳

學習和掌握限制性內切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法，理解限制性內切酶是DNA重組技術的關鍵工具，瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定DNA片段的有效方法。
限制性核酸內切酶：
是一類能識別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。
瓊脂糖凝膠電泳：
是利用瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質的特性，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場的作用下及中性pH的緩沖條件下帶負電的核酸分子就可以向陽極遷移。瓊脂糖凝的濃度影響給定大小的線狀DNA的遷移率，因此采用不同濃度的凝膠可以分離不同大小范圍的dna片段。
EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽, (Ethidium Bromide)。它能夠插入DNA分子中的堿基對之間而與DNA結合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的DNA條帶呈現出紅色熒光，易于檢測。可以檢測10ng 的DNA。
質粒 pCMV-Myc-T10 NEB 標準分子量片段(1kb DNA Ladder) EcoR1 和 Xho1 核酸內切酶（TaKaRa） EcoR 1和 Xho 1酶解緩沖液(10×H buffer) 瓊脂糖 TBE或TAE緩沖液(10×) 溴化乙啶染色液(10mg/ml) 上樣液(6×)：0.25% 溴酚蘭，40％(W/V)蔗糖 水溶液或30％的甘油。 電泳儀，電泳槽，紫外透射儀，凝膠成像儀，一次性塑料手套等 .

1) 質粒DNA的酶解（自提質粒pCMV-Myc-T10）
質粒量(ng)緩沖液(μl)*EcoR1(μl)Xho1(μl)H2O (μl)總體積(μl)I20020017-1920II20020.5015-1720III20020.50.514-1620
* 緩沖液隨不同的酶而不同,本實驗用 H buffer。 置于37℃水浴酶解0.5-1小時。酶解完成后，分別加入10?l 3倍的上樣緩沖液, 然后各取15?l進行電泳分析。

2) 瓊脂糖凝膠的制備:
稱取0.8g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入100ml TBE或TAE工作液，瓶口倒扣一個小燒杯等，將該三角瓶置于微波爐加直至瓊脂溶解。

3）膠板的制備:
取有機玻璃內槽，洗凈、晾干；取紙膠條(寬約1cm)，將有機玻璃內槽置于一水平位置模具上，放好梳子。 將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液，小心地倒在有機玻璃內槽上，控制灌膠速度和量，使膠液緩慢地展開，直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置30min左右，待凝固*后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機玻璃內槽放在含有0.5-1×TAE（Tris-乙酸） 或TBE（Tris-硼酸）工作液的電泳槽中使用。

4）加樣:
用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品孔內。每加完一個樣品，換一個加樣頭。加樣時應防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部，本實驗樣品孔容量約15～20 ul。1 kb DNA ladder（共10條帶）: 在*個上樣孔或zui后一個上樣孔內加入6ul 的 1 kb DNA ladder（50ng/ul ）。