直接免疫熒光法測抗原

一、基本原理：

將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應.其優點是方法簡便.  特異性高，非特異性熒光染色少.缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體.此法常用于細菌.  病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢.  皮膚活檢的免疫病理檢查。

二、試劑與儀器：

1.  磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01 mol/L，pH7.4

2.  熒光標記的抗體溶液：以0.01 mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋

3.  緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2，0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制

4.  搪瓷桶三只（內有0.01 mol/L，pH7.4的PBS 1500 ml）

5.  有蓋搪瓷盒一只（內鋪一層浸濕的紗布墊）

6.  熒光顯微鏡

7.  玻片架

8.  濾紙

9.  37℃溫箱等

三、實驗步驟：

1.  滴加0.01 mol/L，pH7.4的PBS于待檢標本片上，10 min后棄去，使標本保持一定濕度；

2.  滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液，使其*覆蓋標本，置于有蓋搪瓷盒內，保溫一定時間（參考：30 min）；

3.  取出玻片，置玻片架上，先用0.01 mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01 mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時振蕩；

4.  取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋；

5.  立即用熒光顯微鏡觀察.觀察標本的特異性熒光強度，一般可用"+"表示：（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++ --++++）熒光閃亮.待檢標本特異性熒光染色強度達"++"以上，而各種對照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。

四、注意事項：

1.  對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應超過1：20，抗體濃度過低，會導致產生的熒光過弱，影響結果的觀察。

2.  染色的溫度和時間需要根據各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10 min到數小時，一般30 min已足夠.染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0~2℃的低溫，延長染色時間.低溫染色過夜較37℃30 min效果好的多。

3.  為了保證熒光染色的正確性，試驗時需設置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾.

（1）標本自發熒光對照：標本加1~2滴0.01 mol/L，pH7.4的PBS。

（2）特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體。

（3）陽性對照：已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。

    如果標本自發熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。

4.  一般標本在高壓汞燈下照射超過3 min，就有熒光減弱現象，經熒光染色的標本在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。