正常小鼠原代骨骼肌細胞培養

正常小鼠原代骨骼肌細胞培養
 
一、實驗試劑
1、培養基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、凍存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗滌液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
4、染色液： 0.4% Trypan Blue
5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit
6、檢測試劑：鼠抗人及大鼠desmin一抗，肌球蛋白（myosin）單克隆抗體
 
二、實驗器械
1、培養皿
2、培養瓶
3、直剪和眼科剪
4、和
5、燒杯
6、15ml離心管
 
三、實驗流程
取肌肉于平皿，Hank’s洗3次
↓
剔除脂肪、結締組織
↓
肌肉標本剪約0.1cm3小塊
↓
移至離心管，Hank’s洗3次
↓
靜置1min，棄去上層液及漂浮組織
↓
0.25%，37度水浴消化20min，每5min搖動或吹打1次
↓
生長培養基終止消化，反復吹打，依次100，200，400目過篩
↓
離心，1000rmp,10min，棄去上清
↓
重懸，計數細胞，接種密度以5 × 105 個/ml
↓
懸液加入未經PPL包被培養瓶中，差速貼壁去除成纖維細胞，37度，1h
↓
轉移包被瓶中，生長培養基培養，培養37℃，5%CO2
↓
4d換液，以后每天換
 
四、實驗 操作
 
1、  新生小鼠拉頸椎處死，乙醇消毒腿部，在超凈工作臺內，取肌肉于平皿，Hank’s洗3次，剔除脂肪、結締組織，將肌肉標本剪約0.1cm3小塊；
2、  將剪碎的肌肉移至離心管，Hank’s洗3次，靜置1min，棄去上層液及漂浮組織
3、  向上述離心管中加入0.25%，37度水浴消化20min，每5min搖動或吹打1次離心管，然后加入生長培養基終止消化；
4、  反復吹打后，依次100，200，400目過篩，濾液收集后，1000r/min離心10min；
5、  棄去清夜，用生長培養基重懸細胞，懸液加入未經PPL包被的培養瓶中，差速貼壁去除成纖維細胞，37度培養1h后，轉移包被瓶中，生長培養基培養，4d換液，以后每天換液1次。
 
五、細胞鑒定
 
1、顯微鑒定：剛分離出的原代細胞比較小，呈球形，折光性強。12h后，細胞開始貼壁，72h后貼壁*，細胞逐漸延展成梭形，隨著培養時間的延長，細胞增殖、遷移并逐漸規律性地沿一個方向排列。當細胞融合80%以上后，開始形成肌管。
 
2、免疫細胞化學染色1：肌衛星細胞胞漿中含有結蛋白（desmin），可采用鼠抗人及小鼠desmin一抗對衛星細胞進行免疫染色鑒定。
 
3、免疫細胞化學染色2：采用骨骼肌特異性的肌球蛋白（myosin）單克隆抗體檢測。取含骨骼肌細胞蓋玻片常規處理后進行myosin的細胞免疫化學染色，PBS代替一抗做陰性對照。結果判定：以細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性染色。
 
六、注意事項
 
1、消化過程中，也可采用15min兩步消化的方法進行。根據所取組織個體年齡決定，一般成年大小鼠采用兩步消化效果好，幼鼠一步消化和兩步消化差別不大。
 
2、傳代培養代數不要太多，骨骼肌細胞傳代能力有限，容易死亡。
 
3、骨骼肌細胞培養過程中，形態會發生較大變化。
 
4、肌肉組織要盡可能剔除表面的膜和脂肪組織。