1. 準(zhǔn)備工作
俗話說用欲善其事，必先利其器。我強(qiáng)烈建議大家在做構(gòu)建之前先找好工具，這樣起的效果事半功倍。這里說個(gè)笑話，我們系有個(gè)新PHD學(xué)生，是個(gè)印度女孩，很聰明很刻苦，她所在的實(shí)驗(yàn)室也很好，不過除了她之外包括老板在內(nèi)都是生物物理背景的，以前一個(gè)生物POSTDOC在的時(shí)候還好，這個(gè)POSTDOC一走，整個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)分生就只有一個(gè)粗淺的概念，這個(gè)女孩就想把一個(gè)質(zhì)粒上的基因插到另一個(gè)質(zhì)粒上去，要是我就先查查有沒有合適的酶切位點(diǎn)，要沒有就改造一下質(zhì)粒一切搞定，這女孩她不懂啊（要命的是她老板固然牛，對(duì)這方面也不懂），自己辛辛苦苦設(shè)計(jì)了PCR引物去做PCR，P了將近5K的產(chǎn)物去測(cè)序，結(jié)果測(cè)的結(jié)果中間有個(gè)MUTATION，要懂行的就找找酶切位點(diǎn)，從原來的替換上去，然后測(cè)這下這段就行。她呢，又送去了若干了質(zhì)粒一個(gè)接一個(gè)的測(cè)，一個(gè)測(cè)序反應(yīng)這邊是8刀,一個(gè)質(zhì)粒測(cè)下來就是40刀，她光測(cè)序就要花好幾百刀（你得佩服老美實(shí)驗(yàn)室真有錢呀）。
這件事教育我們準(zhǔn)備工作是多么重要。
這里大家兩個(gè)工具，一個(gè)都知道，PRIMER5.0。另一個(gè)工具*大，也不知道國內(nèi)流行不，叫l(wèi)asergene，包括設(shè)計(jì)引物到構(gòu)建圖譜，圖譜非常漂亮，而且分析酶切位點(diǎn)等等就超NB，如果感興趣的話我可以給大家傳一個(gè)圖譜看看。
2. PCR
如果沒有現(xiàn)成的質(zhì)粒可供酶切，PCR是也是zui方便的策略。關(guān)于PCR具體技術(shù)壇子內(nèi)帖很多，我不多說了，這里僅在構(gòu)建方面談一談。
如何設(shè)計(jì)引物?
首先，看懂質(zhì)粒圖譜!
拿大家比較熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子。想用N1質(zhì)粒，設(shè)計(jì)引物就得把下游引物上的中止密碼子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下來結(jié)果根本不表達(dá)融合蛋白，你就死了;C1質(zhì)粒，注意frame，要是移碼了，你也死了。而且PEGFP系列有1.2.3，要弄清楚別弄竄了。一句話，要看懂你的圖譜!再多一句，PEGFP的XBA1和Bcl1位點(diǎn)不能用。
注意在設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)的時(shí)候要加保護(hù)堿基（大家要用T載體就當(dāng)我沒說）。酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)也有一定的講究，我的原則是，能用粘端就用粘端，實(shí)在不能用的就用只好用一些常用的平端酶，如ECORV和SNAB1之類，要是以后還有別的用處就多加點(diǎn)酶切位點(diǎn)，我曾一口氣在引物上加了五個(gè)酶切位點(diǎn)以防以后要用到，注意計(jì)算TM的時(shí)候要減去這些不match的序列，或者選用touch-up策略。
除了酶切位點(diǎn)，還要注意KOZAK序列的問題，很多質(zhì)粒沒有提供KOZAK序列，這要在設(shè)計(jì)的時(shí)候直接在引物上加好。
GENE OVERLAP也比較有用，比方說加個(gè)FLAG片段，HIS片段，2A序列之類的，直接設(shè)計(jì)三引物OVERLAP一下就可以，省得還要再多構(gòu)建一步，這些都是設(shè)計(jì)引物時(shí)候就要考慮好的。
引物長(zhǎng)一點(diǎn)不要緊（我zui喜歡兩步法了），尤其是對(duì)GC比高的序列，有時(shí)候引物不長(zhǎng)PCR根本不出結(jié)果，注意如果GC比較高，這個(gè)時(shí)候GENE OVERLAP就不要做了，很麻煩，克隆很難挑。
沒有合適的酶切位點(diǎn)?
很簡(jiǎn)單，用同尾酶策略，比方說Bgl2和BamH1,Nhe1和spe1，Xho1和Sal1（注意連上了切不下來），實(shí)在不行就平端吧，只要不超過4KB，平端酶連接也不那么難。
如何選擇Taq酶?
選擇Taq酶也很關(guān)鍵，首先，高保真（High fidelity）這是必須的，我在國內(nèi)常用LA KIT，可這邊***忑貴，只好用（美）國貨。常用的PFU，PHUSION和PFX。PFX50是invitrogen公司的，一度曾賣到脫銷，保真性應(yīng)該是目前zui高的，是普通Taq的50倍，對(duì)一般基因*問題（我同事4.5K PCR產(chǎn)物,居然一個(gè)突變都沒有），但是對(duì)比較難PCR的高GC或者位點(diǎn)比較難做PCR的基因（基因組為模板）就明顯不行了;PFU（安捷倫）保真性沒有PFX50高，但是能力很強(qiáng)，略貴點(diǎn);phusion是NEB公司的，不貴，但是這個(gè)酶很怪異，每次用都要把a(bǔ)nnealing溫度調(diào)高好幾度，否則就出雜帶，個(gè)人覺得NEB內(nèi)切酶是，但是Taq就不如Invitrogen了，如果實(shí)驗(yàn)室有錢，直接買invitrogen的spuermix，什么都混好了，連ddH2o都搞定，只要直接向里加模版和引物就OK，每次我要拿漂亮的結(jié)果都用supermix。
還是那句話，讀說明書。同是高保真Taq酶，iproof 要求98度起始1min，pfx就要求95起始2min ，延伸有的是72，有的是68，有的要加1uL,有的加0.5，有的TM要低五度，有的高三度，這些必須要讀說明書，讀且仔細(xì)讀，這是拿到任何試劑都要做的*步。
如果基因太難PCR，怎么辦?
首先，DMSO是好物，好到甚至FISHER的Phusion就直接寫上了DMSO這項(xiàng)，注意3%-6%，太高Taq酶活性就不行了。如果GC太高而且片段過長(zhǎng)的話，DMSO也不行，GC低的不。
我做個(gè)過一個(gè)2.8k,GC比高達(dá)92%的基因PCR，一共做了兩周，從保真性zui強(qiáng)的PFX50到普通的promega 2xGO Taq都試過，什么DMSO，甘油，Biorad的iproof with high GC Buffer, NEB one Taq 2x Taq High GC（還帶Enhancer的），TAKARA 的LA都試過，都不行，要么不出帶，要么就是亂七八糟的帶一起來，頭暈?zāi)X漲的我都打算抹平策略了，后來從別的實(shí)驗(yàn)室弄來一個(gè)clontech的2 GC rich kit，一次搞定!強(qiáng)烈這個(gè)KIT，太牛了，在別家都繳械的時(shí)候，它一錘定音，不過價(jià)格也比別家都牛，10次反應(yīng)就130刀，其實(shí)實(shí)驗(yàn)室大可以備一個(gè)，就是防備超高GC又長(zhǎng)的片段。不過這個(gè)KIT非高保真，送了三個(gè)克隆測(cè)序，各在不同部位有突變，于是我就從A克隆切一段接到B克隆上，又從C克隆切一段接B克隆上。注意的問題是GC比太高測(cè)序也很困難，正常GC能測(cè)1K左右，到了High GC就能測(cè)個(gè)五六百，這時(shí)要多準(zhǔn)備些引物。
PCR產(chǎn)物的純化
如果帶很單一，又強(qiáng)，直接PCR產(chǎn)物純化就可以，如果有雜帶，但目的帶也很強(qiáng)，跑膠，目的帶切膠回收。回收這里也有個(gè)瓶頸，就是回收率的問題，我試過很多家的KIT，promega的GEL回收試劑盒效率和價(jià)格都很合適，這個(gè)。
關(guān)于T載體，我在國內(nèi)的時(shí)候是*的，到了美帝反倒一次沒用過，這邊比較流行直接用PCR產(chǎn)物切，就是回收完了直接切上，回收后然后連接，這又回到了zui開始設(shè)計(jì)，要加保護(hù)堿基。這個(gè)策略好處就是免除了T載體這步，直接插入目的載體，存在的問題就是處于盲做狀態(tài)，還要加保護(hù)堿基。
3. 酶切
我的原則一向是：盡量避免PCR，能酶切的多酶切，實(shí)在沒辦法才去PCR。
這里強(qiáng)烈NEB的內(nèi)切酶，還記得在有一次用別家的酶切過夜，結(jié)果質(zhì)粒都被切碎了（當(dāng)然當(dāng)時(shí)質(zhì)粒濃度也不高），而用NEB的酶，切個(gè)七十二小時(shí)仍舊一切OK，尤其現(xiàn)在NEB還推出了HF的內(nèi)切酶，沒有星活性而且統(tǒng)一都用Buffer4，很好用，在國內(nèi)我都用TAKARA的酶，基本上還可以。
注意要讀說明書，選用什么buffer，多少度，用不用加BSA，這些都要仔細(xì)讀。
酶切的起始量，PCR產(chǎn)物沒甚么可說的，全都切上，如果是從質(zhì)粒上切片段，要根據(jù)你片段大小，片段適中，比如說7kb質(zhì)粒，有2KB是目的片段，這時(shí)切個(gè)3-4ug就足夠了，如果只有0.2KB,那多切點(diǎn)，6ug-7ug 內(nèi)切酶也沒問題。
4. 連接
zui常用的是NEB的T4和Promega的T4,都很好用，但是注意Buffer里有ATP，反復(fù)凍融ATP失活得很快，這時(shí)有兩種辦法，一種是象我們chair實(shí)驗(yàn)室，每次連接都統(tǒng)統(tǒng)朝里面加1uL ATP;另一種是我們實(shí)驗(yàn)室的策略，拿到buffer就分裝，10uL/管，一次性使用，哪怕就用1uL，剩下的直接扔掉。
連接zui重要的注意事項(xiàng)，1，載體總量，2.載體和插入片段比例，3.載體和插入片段質(zhì)量。
我在回收之后都要測(cè)載體濃度，一般來說，載體濃度在20-100ng/uL很好，太低的話碰撞幾率低，太高的話又會(huì)產(chǎn)生很多非目的克隆，總量從50-100ng就可以，太低失敗幾率很高，太高克隆太多，挑克隆會(huì)很麻煩，反應(yīng)總體積也有講究，體積太大載體和目的片段碰撞幾率太低，而且對(duì)感受態(tài)細(xì)胞也是個(gè)挑戰(zhàn)，通用10-15uL，我試過25uL沒有問題，40uL就不行了。
載體和插入片段比例一般是1:3，如果很難連接，比如說平端連接，要適當(dāng)提高載體濃度，同時(shí)加大比例1:10，我試過一端平一端粘連接，4kb片段，4KB載體，連接成功率相當(dāng)高，10個(gè)克隆里8個(gè)都是陽性的，但是7KB片段，5KB載體的平端連接就連試兩周都失敗，zui后換策略分兩段先后克隆進(jìn)去的，這也給了我很深教訓(xùn)，隔了一陣又做類似的實(shí)驗(yàn)，這回我干脆連試都沒試，繼續(xù)分成兩段分別連進(jìn)去的。
3片段連接同理，如果片段不太大，比方說小于3K，3片段連接成功幾率很高，但是如果你片段太大，就不行了，我試過4K載體，4K片段A，2K片段B連接，失敗四五次，zui后還是繞路走了。
5. 轉(zhuǎn)化
這個(gè)簡(jiǎn)單遵循基本的準(zhǔn)則就行，話說實(shí)驗(yàn)室原來從sigma買感受態(tài)（competent cell），后來發(fā)現(xiàn)還是自己做的效率高，尤其在使用XL-10細(xì)菌的時(shí)比DH效率要高，需要的話我可以發(fā)protocol上來。要注意的是LB必須無菌而且沒有抗生素，實(shí)驗(yàn)室原來有個(gè)volunteer，做一次失敗一次，我就奇怪了，后來才發(fā)現(xiàn)他用的居然是加了KANA的LB，直接暈過去了。還有就是氯化鈣的問題。氯化鈣吸水性很強(qiáng)，吸水后就完蛋了，我一般把它放在干燥罐里（反正我也不知道啥名字，就那種玻璃罐，干燥用的），大家要不放心，用之前可以把氯化鈣放在烘箱里烤一烤。
6. 鑒定
普通實(shí)驗(yàn)做酶切鑒定，陽性率非常高，大多數(shù)情況下四個(gè)中起碼有三個(gè)是正確的，很多時(shí)候都是正確，這里一種叫fast digest的酶，切個(gè)十幾分鐘跑膠就行了。
如果找不到合適的酶切位點(diǎn)或者有其他問題，比方說有段時(shí)間我做個(gè)非常新潮的實(shí)驗(yàn)，初始步驟的雖然是藍(lán)白篩選，但是白斑也大部分都不對(duì)，沒辦法鑒定就用菌液PCR，zui夸張的一次是五十個(gè)白斑里面居然就一個(gè)陽性的（沒辦法，該實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)），這要提質(zhì)粒可提不起。菌液PCR也有講究，很多人做菌液PCR鑒定假陽性特多，為甚么?因?yàn)槟鉖CR引物選的都在載體上，注意，引物必須分別在載體和插入片段上才準(zhǔn)，PCR方法鑒定是極其準(zhǔn)確的，我做過數(shù)百次菌液PCR，只要PCR條件正確，PCR和酶切結(jié)果對(duì)得上。PCR鑒定做起來也很簡(jiǎn)單，拿個(gè)2mL tube，裝0.5mL 加入相應(yīng)抗生素的LB，搖個(gè)三小時(shí)左后取1uL做模板就行了，樓下有個(gè)實(shí)驗(yàn)室的POSTDOC特喜歡做直接的菌落PCR，我沒試過，效果怎樣不好說。
還要多說一句，要注意質(zhì)粒是低拷貝還是高拷貝，普通的質(zhì)粒一般4mL搖過夜，1.5mL就能提到500ng/uL 總體積40uL的質(zhì)粒（根據(jù)試劑盒不同，zui高提過800ng/uL，也試過200ng/ul，都正常）。如果是低拷貝質(zhì)粒，象PET系列和pshuttle系列，都是低拷貝，能拿到100ng/uL就已經(jīng)很好了，這時(shí)候需要4ML菌當(dāng)2ML提，但是zui要命的還是Adeasy 質(zhì)粒（用來做腺病毒的），這個(gè)質(zhì)粒超過30KB，普通KIT回收效率低到忍無可忍，一定要用特定的試劑盒才行，還是那句話，這些都要讀說明書。
7. 測(cè)序
我們拿到測(cè)序結(jié)果時(shí)候，不僅要核對(duì)具體的序列，而且要看測(cè)序圖，這很重要，因?yàn)橛袝r(shí)候光看結(jié)果對(duì)，實(shí)際上圖顯示的不對(duì)，或者雖然結(jié)果不對(duì)，但是圖上出現(xiàn)的峰值本身就很怪異不可信，出現(xiàn)突變也不怕，有很大可能性是簡(jiǎn)并密碼子，還要重點(diǎn)檢查的地方就是“接頭”的地方，因?yàn)榕紶栆飼?huì)出錯(cuò)，比方說少個(gè)堿基什么的，還有時(shí)候酶切之后連接也會(huì)丟一或者倆堿基什么的（這些問題我都碰到過），如果不仔細(xì)檢查到了后期悔之無及。
還要注意反向測(cè)序引物，尤其用到SV40，因?yàn)槲矣肞EGFP這套質(zhì)粒用習(xí)慣了，等換成大概是TET-ON那套系統(tǒng)，SV40正好是反過來的，我也沒留神，結(jié)果測(cè)回來的是載體……又吃了一次教訓(xùn)。
