發現tRNA衍生的小RNA在植物抗真菌防衛反應中的功能

轉運RNA（tRNA）是一種由76-90個核苷酸（nt）組成的RNA分子，它的經典功能是在蛋白質翻譯過程中負責將mRNA序列轉譯為氨基酸序列。tRNA具有三葉草形的二級結構，這種結構由氨基酸接受莖、D（二氫尿苷酸）莖環、反密碼子莖環和TψC莖環（ψ代表假尿苷酸）組成。近年來的研究發現，在人和動植物中，tRNAs可被切割加工，產生多種小RNAs。當切割位于反密碼子環時，產生5′和3′ tRNA半分子（tRNA halves）；當切割位于TψC環時，產生3′ tRNA衍生的小RNA（3′ tsRNA）；而當切割發生在D環、D莖或5′反密碼子莖時，則產生5′ tRNA衍生的小RNA (5′ tsRNA)。

在植物中，5′ tRNA half和5′ tsRNA是豐度的兩類tRNA衍生小RNAs，但其產生機制以及生物學功能尚不明確。清華大學生命科學學院戚益軍課題組利用新開發的小RNA測序方法，系統分析了模式植物擬南芥中5′ tRNA halves和5′ tsRNAs，并發現5′ tsR-Ala通過調節靶基因CYP71A13的表達和植保素的合成，從而調控植物抗真菌防衛反應。

相關研究論文“一個5′ tRNA-Ala衍生的小RNA調控植物抗真菌防衛反應" （A 5′ tRNA-Ala-derived small RNA regulates anti-fungal defense in plants）在線發表在《中國科學》（SCIENCE CHINA Life Sciences）上。

在這項研究中，戚益軍課題組首先針對tRNA衍生小RNAs的特征，開發了一種基于RtcB連接酶的小RNA文庫構建及測序方法（RtcB sRNA-seq），該方法能夠同時捕捉并定量區分末端為3′羥基和3′磷酸/環磷酸的小RNAs。利用RtcB sRNA-seq，系統鑒定分析了擬南芥幼苗中5′ tRNA halves和5′ tsRNAs，發現80個tRNAs可產生近千個5′ tRNA halves和5′ tsRNAs，其中tRNA-Ala、tRNA-Gly和tRNA-Glu衍生的5′ tRNA halves和5′ tsRNAs豐度。tRNA-Ala主要產生19-nt的 5′ tsR-Ala，tRNA-Gly主要產生18-nt的5′ tsR-Gly和35-nt 5′ tRNA-Gly half，而tRNA-Glu則主要產生15-nt的5′ tsR-Glu和35-nt 5′ tRNA-Glu half（圖1）。

該研究進一步著重探索了5′ tsRNAs的產生機制及生物學功能。通過分析RNase T2家族RNA內切酶RNS1至RNS5突變體中5′ tsRNAs的積累，發現RNS1和RNS3負責產生包括5′ tsR-Ala在內的眾多5′ tsRNAs。為了研究5′ tsRNAs的生物學功能，利用RNA測序方法分析了rns1和rns3突變體的基因表達譜，發現突變體中大量參與植物抗真菌的茉莉酸信號通路基因上調表達。灰霉菌接種實驗表明，與野生型植物相比，rns1和rns3突變體更抗灰霉菌侵染（圖2）。這些結果說明RNS1和RNS3可通過切割tRNAs產生5′ tsRNAs，負調控植物對灰霉菌的抗性。

該研究最后闡明了其中一個豐度的5′ tsRNA，19-nt 5′ tsR-Ala的功能。發現5′ tsR-Ala能夠與AGO1結合，并切割與其序列互補的靶標CYP71A13 mRNA，從而負調控CYP71A13基因的表達。CYP71A13編碼植保素（植物產生的一種抗菌分子）合成途徑中的一個關鍵酶。利用短串聯模擬靶標（STTM）技術沉默5′ tsR-Ala，發現在5′ tsR-Ala沉默的植物中， CYP71A13表達上升，植保素含量增加，對灰霉菌抗性增強。特別有意思的是，研究發現植物在受到灰霉菌侵染時，包括5′ tsR-Ala在內的眾多5′ tsRNA積累水平下降。

根據上述結果，該研究提出了植物中5′ tsR-Ala調控植物抗真菌防衛反應的工作模型（圖3）。在沒有真菌侵染的情況下，植物通過RNS1和RNS3切割tRNA-Ala生成5′ tsR-Ala，5′ tsR-Ala與AGO1結合，切割CYP71A13 mRNA，從而抑制植保素合成和植物對真菌的防衛反應；而當真菌入侵時，植物通過下調5′ tsR-Ala的產生水平，增強CYP71A13的表達和植保素的合成，從而激活植物的防衛反應