把一個(gè)有用的目的DNA段通過重組DNA技術(shù),送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具叫載體(Vector)。細(xì)菌質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。
質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能存活,而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對抗生素的抗性等。F質(zhì)粒(又稱F因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒(抗藥性因子)和Col質(zhì)粒(產(chǎn)大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質(zhì)粒。
質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型:緊密控制型(Stringent control)和松馳控制型(Relaxed control)。前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制,當(dāng)染色體不復(fù)制時(shí),它也不能復(fù)制,通常每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有1個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子,如F因子。后者的質(zhì)粒在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制,在每個(gè)細(xì)胞中有許多拷貝,一般在20個(gè)以上,如Col E1質(zhì)粒。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑-時(shí),細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、染色體DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂均受到抑制,緊密型質(zhì)粒復(fù)制停止,而松馳型質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制,質(zhì)粒拷貝數(shù)可由原來20多個(gè)擴(kuò)增至1000-3000個(gè),此時(shí)質(zhì)粒dna占總DNA的含量可由原來的2%增加至40-50%。
利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共同存在,當(dāng)兩種質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入同一細(xì)胞時(shí),它們在復(fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過程中彼此競爭,在一些細(xì)胞中,一種質(zhì)粒占優(yōu)勢,而在另一些細(xì)胞中另一種質(zhì)粒卻占上風(fēng)。當(dāng)細(xì)胞生長幾代后,占少數(shù)的質(zhì)粒將會(huì)丟失,因而在細(xì)胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種，這種現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒則可以穩(wěn)定地共存于同一宿主細(xì)胞中。
質(zhì)粒通常含有編碼某些酶的基因,其表型包括對抗生素的抗性,產(chǎn)生某些抗生素,降解復(fù)雜有機(jī)物,產(chǎn)生大腸桿菌素和腸毒素及某些限制性內(nèi)切酶與修飾酶等。
質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的。與天然質(zhì)粒相比,質(zhì)粒載體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因)和一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量盡可能減少,以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列,這些用途包括通過組織化學(xué)方法肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生用于序列測定的單鏈DNA、體外轉(zhuǎn)錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達(dá)等。一個(gè)理想的克隆載體大致應(yīng)有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；（2）具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)；（3）能插入較大的外源dna段；（4）具有容易操作的檢測表型。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡稱pBS）等。
從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟:培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞;分離和純化質(zhì)粒DNA。采用可以破壞菌體細(xì)胞壁,十二烷基磺酸鈉(SDS)和Triton X-100可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)和SDS或Triton X-100處理后,細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上,同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNA變性,而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circular DNA，簡稱cccDNA)的兩條鏈不會(huì)相互分開，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA段難以復(fù)性,而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起,而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中。
在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會(huì)產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱開環(huán)DNA(Open circular DNA, 簡稱 ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA(Linear DNA)。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時(shí),同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動(dòng)速度快。
