一、動物免疫
動物體內(nèi)的b淋巴細(xì)胞在特定外來抗原的刺激下，可以大量增殖變成漿細(xì)胞以分泌針對于該抗原的抗體。脾內(nèi)不同的B淋巴細(xì)胞克隆可分泌針對不同抗原的抗體。當(dāng)受到特定外來抗原刺激時，相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞克隆便大量增殖以分泌相應(yīng)的特異性抗體。動物免疫的作用就是用特定外來抗原對動物進(jìn)行一次或多次免疫，以刺激能分泌針對于該抗原抗體的B淋巴細(xì)胞大量增殖，從而得到大量產(chǎn)生專一的B淋巴細(xì)胞。
二、細(xì)胞融合
B淋巴細(xì)胞受外來抗原刺激后可以分泌抗體，但它在體外存活很短時間(zui多兩周)后即死亡；而骨髓瘤細(xì)胞不分泌任何免疫球蛋白，卻能在體外存活。如果能將這兩種細(xì)胞的特性結(jié)合起來，我們就能得到既能分泌抗體又能在體外存活的細(xì)胞。
脾臟是動物體內(nèi)B淋巴細(xì)胞集中的zui大免疫器官, 取出脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)和骨髓瘤細(xì)胞融合后，能產(chǎn)生五種細(xì)胞類型；未融合的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞, 自身融合的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，以及脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞。其中雜交瘤才是我們需要的，因此就要設(shè)法將此雜交瘤細(xì)胞從上述細(xì)胞混合液中挑選出來。
三、雜交瘤細(xì)胞的篩選
在細(xì)胞融合后，要從上述五種細(xì)胞中篩選出雜交瘤細(xì)胞，一般使用HAT培養(yǎng)進(jìn)行篩選，HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三種成分。細(xì)胞的DNA合成有內(nèi)源性途徑(主要途徑)和外源性途徑(旁路途徑)兩種方式。內(nèi)源性途徑就是利用或單磷酸尿苷酸在二氫還原酶的催化下來合成DNA；而外源性途徑則是利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase, HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下來補(bǔ)救合成DNA，HAT培養(yǎng)基中氯基喋呤是二氫還原酶的抑制劑, 能有效地阻斷DNA合成的內(nèi)源性途徑。B淋巴細(xì)胞具有HGPRTTK這兩種酶, 因此在內(nèi)源性途徑被阻斷后仍能利用HAT培養(yǎng)基中的次黃嘌呤和胸腺嘧啶來合成DNA，可在HAT培養(yǎng)基中存活, 但B淋巴細(xì)胞是正常細(xì)胞, 故不能存活。雜交瘤技術(shù)中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞為HGPRT-的TK-缺陷型, 缺乏HGPRT酶和TK酶在內(nèi)源性途徑被阻斷后不能進(jìn)行DNA的外源性合成，故不能在HAT培養(yǎng)基中存活。雜交瘤細(xì)胞由于繼承了B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的雙重特性，能夠合成HGPRT酶和TK酶，故在HAT養(yǎng)基中能存活。因此將融合后的混合細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周后，只有雜交瘤細(xì)胞能存活下來，成為制造單克隆抗體的細(xì)胞源。
實(shí) 驗(yàn) 用 品
一、器材
1. 主要設(shè)備: 無菌室一間(或超凈臺一臺), 普通離心機(jī)一臺, 倒置顯微鏡一架, 酶聯(lián)免疫檢測儀一臺, CO2恒溫培養(yǎng)箱一臺, 恒溫水浴一臺, 高壓滅菌名鍋一個。
2. 小型器材: 二塊, 25ml和50ml培養(yǎng)瓶20個, 96孔和24孔培養(yǎng)板各10塊, 40孔酶標(biāo)板20塊, 50ml塑料離心管6支, 10ml玻璃離心管10支, 1ml、5ml和10ml吸管各4支, 6cm培養(yǎng)皿2套, 100ml和50ml培養(yǎng)液瓶各10個, 1ml、5ml和10ml注射器各2支, 小滴管8支, 玻璃套管4, 中、小型刀各2把, 中、小型手術(shù)鑷各2把, 6號針頭8個, L型6號針頭2個, 500ml和1000ml杯各2個, 酒精燈一盞, 不銹鋼網(wǎng)(55cm 200目)2塊, 解剖盤2個, 培養(yǎng)液抽濾滅菌裝置一套, 橡皮塞若干, 70%酒精棉若干。
二、材料
8~12周齡BALB/c純系小鼠10只；SP2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞；滅活人輪狀病毒(用作抗原)。
三、試劑
RPMI 1640培養(yǎng)基, 小牛血清(FCS), GKN液, 50%PEG液, HT培養(yǎng)液, HAT培養(yǎng)液, 0.5% 臺盼藍(lán)(trypan blue), 1 mol/L NaOH, 1 mol/L HCl, 包被液, 底物反應(yīng)液, 辣根過氧化物酶羊(或兔)抗鼠IgG, , 。
