細胞融合法提高HBsAg表達量方法研究

The study on enhancing expression of HBsAg with the cell fusion 
He Wei，Jin Lijie，Li Yong，et al. 
Changchun Institute of BioLogical Product，Changchun130062. 
【Abstract】 Objective To enhance the expression of HBsAg.Methods We make
the CHO-C 28 Cell exˉpressing HBsAg and NS-1cell fuse together，and then determine the titre by RPHA.Results There are transient high expression
in the eleventh day after fusion，the titre of HBsAg is1:2048，that of control group is not more than1:256.Conclusion The fusion method can 
enhance the expression of HBsAg，the result of this experiment provide eviˉdences for further research. 
Key words CHO-C 28 cell NS-1cell cell fusion expression of HBsAg 
CHO-C 28 細胞是一種能夠表達HBsAg的重組中國倉鼠卵巢細胞株，目前已投入大規模生產。提高HBsAg的表達水平，不僅可以提高疫苗產量，還會大幅度降低生產成本，一直是我們研究的方向。Cartwright ［1］ 報告，將骨髓瘤細胞SP2/0與能表達t-PA的CHO細胞融合，結果明顯提高了t-PA的表達量。據此，我們將CHO-C 28 細胞與骨髓瘤細胞NS-1融合，結果出現了瞬時高表達，表明此方法可以提高HBsAg的表達量。 
1 材料與方法 
1.1 材料 CHO-C 28 細胞:本室保存種子庫提供。NS-1細胞，8-AG，HAT，PEG-4000:由博德公司李勇老師惠贈。DMEM培養基:由美國GIBCO公司生產。小牛血清:由杭州四季青工程材料研究所生產。RPHA試劑盒:蘭州生物制品研究所生產。 
1.2 方法 ［2］ 
1.2.1 NS-1細胞的制備 為確保細胞對HAT培養基的敏感性，復蘇穩定后，移種于含1%8-AG的DMEM培養基中，融合前1周換用無8-AG的培養液。 
1.2.2 CHO-C 28 細胞的制備 復蘇穩定的細胞，融合前用不含MTX的培養基傳代一次，備用。 
1.2.3 細胞融合 采用聚乙二醇法。收集對數生的CHO-C 28 細胞與NS-1細胞（比例約為1:2），用單純DMEM混合后分為3份分別離心，800r/min離心8min，棄上清液，加入50%PEG-40000.8ml于37℃水浴中融合，加預熱的單純DMEM終止PEG作用，800r/min離心6min收集細胞。棄上清液，3份融合細胞分別加入不同的選擇培養基輕輕混懸，各移種于96孔培養板，100μl/每孔，37℃，5%CO 2 培養。1號板選擇培養基為:1%8-AG+HAT;2號板為:2%8-AG+HAT;3號板為:HAT。培養至第7天時全量換2%8 -AG+HAT液。 
1.2.4 對照 融合前留取部分CHO-C 28 細胞，移種于另一96孔板，加*DMEM培養基，為對照孔。 
1.2.5 檢測 采用反向血凝法檢測HBsAg表達量。 
2 結果 
2.1 形態學檢測 光學顯微鏡下可見:融合細胞培養至5～7d，3塊板未融合的NS-1細胞趨于死亡，7～9d，1號，2號板未融合的CHO-C 28 細胞趨于死亡，雜交瘤出現并緩慢分裂生長，形態呈上皮型，與CHO-C 28 細胞類似，體積稍大。3號板的CHO-C 28 母本細胞與融合細胞共同旺盛生長。未融合的對照細胞生長也很旺盛。