sirna的設(shè)計(jì)是決定RNA干擾實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵步驟，然而并非每個(gè)siRNA都能有效引發(fā)基因沉默，因而siRNA的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)尤為重要，siRNA的設(shè)計(jì)工具也應(yīng)運(yùn)而生。因此，生物幫小編總結(jié)了部分幫友的成功經(jīng)驗(yàn)供大家參考。
經(jīng)驗(yàn)1：如果是自行設(shè)計(jì)siRNA的話，一個(gè)目標(biāo)基因至少設(shè)計(jì)3-5個(gè)以上的siRNAs，平行實(shí)驗(yàn)以期提高成功率。據(jù)評(píng)估，隨機(jī)設(shè)計(jì)的siRNA有25%的機(jī)會(huì)有效沉默基因表達(dá)(減少75%-95%以上的mRNA)，一半以上的幾率能達(dá)到50%的沉默效果。
經(jīng)驗(yàn)2：siRNA的反義鏈3'端以UU結(jié)尾，這被*是zui有效的的siRNA結(jié)構(gòu)。現(xiàn)在以其他堿基結(jié)尾的siRNA也有報(bào)道能成功引發(fā)RNAi，你可以嘗試。不過如果是體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA，要避免以G結(jié)尾，因?yàn)楹罄^處理時(shí)RNAse會(huì)切除末端的G。
經(jīng)驗(yàn)3：多個(gè)siRNAs位點(diǎn)分散分布在mRNA全長(zhǎng)上。沒有數(shù)據(jù)表明siRNA在mRNA上的前后位置和RNAi效果有什么特別的關(guān)系。如果siRNA位點(diǎn)因?yàn)閙RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)或者蛋白結(jié)合的屏蔽而影響siRNA效果，分散分布可以減少風(fēng)險(xiǎn)。不過，也有報(bào)道說，如果可能，能避開起始的50-200個(gè)堿基，以避開潛在的調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
經(jīng)驗(yàn)4：避開和其他基因同源序列，以免“誤傷群眾”。潛在的目標(biāo)序列都到這里BLAST一下，www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ，和其他基因有16個(gè)以上堿基同源的序列一定槍斃掉。
經(jīng)驗(yàn)5：GC比例30%-50%比高GC含量的siRNA的成功率要高些。有較多選擇時(shí)留意。不要有連續(xù)9個(gè)以上的GC。也盡量避免出現(xiàn)連串的某個(gè)堿基。根據(jù)Schwards的文章，由于siRNA雙鏈上只有一條鏈會(huì)結(jié)合RISE上，究竟哪條鏈取決于RNA解旋酶，而正義鏈5' 端以GC開頭，且5'端1-4個(gè)堿基GC含量高，且16-19位堿基GC含量低的序列得到的siRNA反義鏈5'端GC含量低3'GC含量高(也有研究表明反義鏈5'端前7個(gè)堿基至少有5個(gè)AU)，使得反義鏈比較容易正確結(jié)合RISE，因而基因沉默效果比較好。
經(jīng)驗(yàn)6：如果是shrna表達(dá)載體，用的是RNA聚合酶III類的啟動(dòng)子如U6，的結(jié)構(gòu)是5’GN(19)，后面連續(xù)4個(gè)U結(jié)尾即可令轉(zhuǎn)錄終止，要避免序列中j減出現(xiàn)連續(xù)的U/A。
經(jīng)驗(yàn)7：芝加哥大學(xué)的Anne Cahill這樣說：“我比較喜歡采用siSearch 來設(shè)計(jì)shRNA.。我喜歡是因?yàn)樗梢愿鶕?jù)一些列公開的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)返回一個(gè)評(píng)分。我并不相信某一個(gè)或者某一類設(shè)計(jì)法則是的，我曾經(jīng)試過8個(gè):siRNA設(shè)計(jì)，輸入同一個(gè)序列，希望找到一致的目標(biāo)位點(diǎn)，不過結(jié)果令人絕望。所以我不會(huì)僅僅盲目的選擇siSearch評(píng)分zui高的的序列，我會(huì)嘗試其他標(biāo)準(zhǔn)比如預(yù)測(cè)反義鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)和和目標(biāo)mRNA上的定位，同時(shí)再看看RNAi Consortium或者RNAi Codex有沒有我的目標(biāo)序列。”
準(zhǔn)備在體外轉(zhuǎn)錄的RNA干擾，siRNA表達(dá)載體，或PCR生成的siRNA表達(dá)盒，必須準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)哪０濉＿@些模板設(shè)計(jì)基于Web的工具可用于以下Ambion公司包/產(chǎn)品：siRNA沉默構(gòu)建試劑盒、pSilencer siRNA表達(dá)載體、快速的沉默siRNA表達(dá)盒試劑盒、siRNA沉默的雞尾酒套件(核糖核酸酶)。
