RNA抽提之應知應會

對大部分實驗人員來說，RNA 抽提比基因組 DNA 抽提要困難得多。事實上，現有的 RNA 抽提方法/試劑，如果用于從培養細胞中抽提 RNA，比抽提基因組 DNA 更方便，成功率也更高。那為什么同樣的方法用于組織 RNA 的抽提，總會碰到問題呢？ 
組織 RNA 抽提失敗的兩大現象是： RNA 降解和組織內雜質的殘留。關于降解問題，首先看一下為什么從培養細胞中抽提 RNA 不容易降解。現有的 RNA 抽提試劑，都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培養細胞中加入裂解液，簡單的混勻，即可使所有的細胞與裂解液充分混勻，細胞被*裂解。細胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住細胞內的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是說，培養細胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其 RNA 不容易被降解；反過來講，組織中的 RNA 之所以容易被降解，是因為組織中的細胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。因此，假定有一種辦法，在抑制 RNA 活性的同時能使組織變成單個細胞，降解問題也就可以*解決了。液氮碾磨就是zui有效的這樣一種辦法。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，如果碰到樣品數比較多的時候更加會有此感覺。這樣就產生了退而求其次的方法：勻漿器。勻漿器方法沒有考慮細胞與裂解液接觸前如何抑制 Rnase 活性這個問題，而是祈禱破碎組織的速度比細胞內的 Rnase 降解 RNA 的速度快。電動勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來說，勻漿器方法是不能杜絕降解現象的。因此，如果抽提出現降解，原來用電動勻漿器的，改用液氮碾磨；原來用玻璃勻漿器的，改用電動勻漿器或者直接用液氮碾磨，問題幾乎 能獲得解決。影響后續實驗的雜質殘留問題，其原因比降解更多樣，解決方法響應也不同。總之，如果出現降解現象或者組織內雜質殘留現象，則必須對具體實驗材料的抽提方法/試劑進行優化。優化大可不必使用您的寶貴樣品：可以從市場上購買一些魚/雞之類的小動物，取相應部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白質 – 用嘴碾磨，腸胃抽提。 
究竟怎樣才能確保 RNA 抽提的成功率呢？實驗前選擇合適的方法/試劑，這是zui重要的一步；好的方法/試劑在確保成功的同時，操作方便，經濟實用。當然，您的選擇可能仍然有問題，這就需要能正確分析實驗失敗的原因，以便改進。 
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實驗前方法/試劑的選擇 
 
0：抽提 RNA 的目的 
RNA 用于不同的后續實驗，其質量要求不盡相同。cDNA 文庫構建要求 RNA 完整而無酶反應抑制物殘留；Northern 對 RNA 完整性要求較高，對酶反應抑制物殘留要求較低；PCR" onclick="tagshow(event)" class="t_tag">RT-PCR 對 RNA 完整性要求不太高，但對酶反應抑制物殘留要求嚴格。投入決定產出；每次都以獲得zui高純度的 RNA 為目的，勞民傷財。 
 
1：樣品的收集/保存 – 影響降解的因素 
樣品離開活體/或者原來的生長環境后，樣品中的內源酶即會開始降解 RNA，降解速度與內源酶含量及溫度有關。傳統上，只有兩個辦法可以*抑制內源酶活性：立即加入裂解液并且*而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入液氮冷凍。這兩個辦法都要求操作快速。后者適合所有的樣品，而前者只適合細胞及內源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。具體地講，植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等都先用液氮冷凍起來，再往下做。