分子標記常見問題及其對策

1 顯性標記與選擇效率

一部分分子標記系統如RAPD、AFLP具有顯性或部分顯性的特點，無法區分基因是純合還是雜合，不能提供完整的遺傳信息。Haley等（1994）提出相斥相（Repulsion－phase）的RAPD標記無論對顯性還是隱性均可地提高選擇效率，他們找到了和菜豆普通花葉病毒抗性基因bc-3連鎖相引標記-1，相斥標記bc-2，用標記-1選擇純合抗病株、雜合體、純合感病株分別占26.3%，72.5%和1.2%，用標記-2選擇分別占81.8%，18.2%和0，當兩個標記同時使用時，即相當于一個共顯性標記，與標記2的選擇效率相同。這種方法解決了MAS中，顯性標記不能區分純合、雜合基因型的缺陷。

2 基因型限制

zui有價值的標記是在廣泛的基因背景下都能表表達，并能檢測出來的標記。然而，目的基因與標記的連鎖距離因遺傳背景的不同而存在差異。標記與目的基因的遺傳距離是影響輔助選擇效率的一個重要因素。菜豆上，來源于Andean的抗性基因的RAPD標記在Middle America的遺傳背景下表現緊密連鎖，反之也成立。但在供體遺傳背景下，RAPD標記就失去了選擇能力。Andean中OA141100不能用來選擇UP-2基因，OA141100標記的應用被局限在Middle America內。RAPD標記連鎖距離的差異,影響了在不同遺傳背景下的選擇效果，尋找無重組的RAPD標記或將RAPD標記轉化為RFLP標記，可以解決這個問題。

3 標記的穩定性和可操作性

常用分子標記技術在基因標記等方面發揮了巨大作用，卻存在一些缺點，如RFLP、AFLP等，成本高，操作繁瑣，周期長，又有放射性污染，不適合于大樣本選擇。RAPD雖無上述缺點，但卻存在穩定性差的弊端，將它們轉化為特異性擴增子多態性（Specific Amplificon Polymorphism，SAP）或稱目標性狀位點（Sequence Tagged Sites，STS）可以解決這些缺點。主要包括以下兩種1）酶切擴增多態性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAP）對RFLP探針的兩端測序，合成22引物進行pcr擴增，擴增產物往往無多態性，需用內切酶酶解產物，產生多態性。2）序列特異性擴增區（Sequence-characterized Amplified Region，SCAR），對RAPD片段兩端測序，根據所測DNA序列，合成24bp雙引物進行PCR擴增。SCAR、CAP可以降低成本，操作簡便，穩定性強，對儀器要求低，適合于大樣本、快速分析。