DNA重組技術：連接

時間：2015/12/21閱讀：801

實驗原理：質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb＝且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成。但在實際工作中, 如何區分插入有外源DNA的重組質粒和無插入而自身環化的載體分子是較為困難的。通過調整連接反應中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環化限制在一定程度之下,也可以進一步采取一些特殊的克隆策略,如載體去磷酸化等來zui大限度的降低載體的自身環化,還可以利用遺傳學手段如α互補現象等來鑒別重組子和非重組子。
外源dna片段和質粒載體的連接反應策略有以下幾種：
1、帶有非互補突出端的片段用兩種不同的限制性內切酶進行消化可以產生帶有非互補的粘性末端,這也是zui容易克隆的DNA片段。
2、帶有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。
3、帶有平末端是由產生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產生，或由DNA聚合酶補平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應中，T4 dna連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進DNA分子凝聚成聚集體的物質以提高轉化效率。
特殊情況下，外源DNA分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,則可以在線狀質粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli dna聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3’凹端,使不相匹配的末端轉變為互補末端或轉為平末端后再進行連接。

一、材料 PUC，ΛDNA

二、設備恒溫搖床，臺式高速離心機，
恒溫水浴鍋，，
電熱恒溫培養箱，電泳儀無菌，
超凈工作臺，微量移液槍，Tip. eppendorf管。

三、試劑 10X bf T4 鏈接酶
瓊脂糖 TAE
Marker EB
溴酚蘭

四、連接反應

DNA重組技術：連接

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