雙向電泳的樣品的制備原則及步驟

樣品制備原則

樣品制備是雙向電泳中zui關鍵的一步，將直接影響 2-DE 結果好壞。目前并 沒有一個通用的樣品制備方法，盡管處理方法多種多樣，但都遵循幾個基本的原則：1. 盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提zui大量的總蛋白，減少蛋白質的 損失；2. 減少對蛋白質的人為修飾；3. 破壞蛋白質與其他生物大分子的相互作 用，并使蛋白質處于*變性狀態。

根據這一原則，樣品制備需要四種主要的試劑：離液劑(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性劑（sufactants），也稱去垢劑， 如 CHAPS 與 Zwittergent 系列等雙性離子去垢劑；還原劑（reducing agents），zui常用的是二硫蘇糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP）等。當然，也可以選擇性 的加入 Tris-base,蛋白酶抑制劑以及核酸酶。

樣品的來源不同，其裂解的緩沖液也各不相同。通過不同試劑的合理組合， 以達到對樣品蛋白的zui大抽提。在對樣品蛋白質提取的過程中，必須考慮到去除 影響蛋白質可溶性和 2DE 重復性的物質，比如核酸、脂、多糖等大分子以及鹽 類小分子。大分子的存在會阻塞凝膠孔徑，鹽濃度過高會降低等電聚焦的電壓， 甚至會損壞 IPG 膠條，這樣都會造成 2-DE 的失敗。樣品制備的失敗很難通過后 續工作的完善或改進獲得補償。

核酸的去除可采用超聲或核酸酶處理，超聲處理應控制好條件，并防止產生 泡沫；而加入的外源核酸酶則會出現在zui終的2D 膠上。脂類和多糖都可以通過 超速離心除去。透析可以降低鹽濃度，但時間太長；也可以采取凝膠過濾或沉淀 / 重懸法脫鹽，但會造成蛋白質的部分損失。

因此，樣品制備方法必須根據不同的樣品、所處的狀態以及實驗目的和要求 來進行選擇。目前有很多方法適于 2-DE，如組織或細胞的總蛋白提取物、亞細 胞組份或細胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亞組份蛋白（如磷酸化蛋白、采用 親合純化凝集素結合蛋白等）。

一、細胞樣品

1. 細胞培養，加藥與處理。

2. 消化貼壁細胞，PBS 漂洗 3 次(1500g，5min)，棄上清，再次離心，去盡殘液（非常重要！） 。如要比較細胞膜蛋白組的差別，用細胞刮收細獲胞。如用 10mMTris/250 mMSucrose(pH7.0)代替 PBS，可有效降低樣品的鹽濃度。加入5倍體積裂解液，混勻（或將 1×10⁶ 細胞懸于 60～100μl 裂解液中） 。

3. 加 50ug/mlRNase 及 200ug/mlDnase，在 4℃放置 15 分鐘。

4. 15,000 轉，4℃離心 60 分鐘（或 40,000 轉，4℃離心 30 分鐘） 。

5. 收集上清。

6. 測定蛋白濃度( 采用 BioRadRC/DCprotein assaykit)。

7. 分裝樣品，凍存于－70℃。

二、組織樣品

1. 碾缽碾磨組織，碾至粉末狀。

2. 將適量粉末狀組織轉移至勻漿器，加入適量裂解液，進行勻漿。

3. 加 50ug/mlRNase 及 200ug/mlDNase，在 4℃放置 15 分鐘。

4. 15,000 轉，4℃離心 60 分鐘（或 40,000 轉，4℃離心 30 分鐘） 。

5. 收集上清，測定蛋白濃度。

6. 分裝樣品，凍存于－70℃。

注意事項：

1. 8 mmol/L PMSF 必須在添加還原劑之前用，否則 PMSF 會失去活性。

2. 40 mmol/L 濃度以下的 Tris可使有些蛋白酶在高 pH 值下失活。

3. 細胞清洗――大多用 PBS， 若PBS 殘留于細胞表面會造成膠上出現水平條紋，則可利用(10 mmol/L Tris,250 mmol/L sucrosepH 7.0)來解決此問題。