細(xì)胞/組織裂解液

. 溶液準(zhǔn)備  

2×樣品緩沖液：130mM Tris-HCl （ pH8.0 ）  , 20% （ v/v ） 甘油 , 4.6% （ w/v ） SDS , 0.02% 溴酚藍(lán) ,

2%DTT

PBS （ pH7.4 ） :10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4 ，50mM NaCl，2.7mM KCl

RIPA緩沖液：50mM Tris-HCl（pH7.4），150mM NaCl，1mM EDTA，1%Triton×100 ，1%去氧膽酸鈉，0.1%SDS，1mM PMSF，1μg/ml 牛抑制劑 （ aprotinin ），1μg/ml亮抑蛋白酶肽 （ leupeptin ）

裂解液緩沖液：10mM Tris-HCl（pH7.4），0.15M NaCl，5mM EDTA（pH8.0），1%Triton×100；使用前加5mM DTT，0.1mM PMSF異丙醇和5mM ε-。

2. 裂解液的制備

A. 制備細(xì)胞裂解液：

①收集消化的細(xì)胞并離心，用PBS清洗。

②用100μl RIPA緩沖液冰浴溶解沉淀10min（每500000個(gè)細(xì)胞20μl RIPA緩沖液）。

③10000rpm，4℃離心10min，取上清轉(zhuǎn)移至新管。

④用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。

⑤用裂解緩沖液將溶液濃度調(diào)到5mg/ml,每小瓶中放100μl，-80℃儲(chǔ)存。

⑥按照1:1體積比混合2×樣品緩沖液，煮沸5min后，室溫放置5min.

⑦短時(shí)離心后點(diǎn)樣電泳檢測(cè)。

B． 制備組織裂解液：

①在制備過(guò)程中一直將溶胞液或組織放在冰上。

②切開(kāi)組織，稱(chēng)取組織1.5g于PBS中清洗。

③在RIPA緩沖液中剪碎組織后，轉(zhuǎn)移到勻漿器中，加足5ml RIPA緩沖液，研磨20min.

④將研磨液轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，14000rpm，4℃離心10min.

⑤取上清液作為完整的組織裂解液。

⑥用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

⑦用裂解緩沖液將溶液濃度調(diào)到5mg/ml，每小瓶中放100μl，-80℃儲(chǔ)存。

⑧按照1:1體積比混合2×樣品緩沖液，煮沸5min后，室溫放置5min.

⑨短時(shí)離心后點(diǎn)樣電泳檢測(cè)。