士鋒生物水稻萌發及幼苗期和過氧化氫酶活性測定

實驗目的：幾乎存在于所有植物中，其中以禾谷類種子的活性較強。水稻萌發時活性zui強。水稻萌發時淀粉活性的大小與種子萌發力有關。過氧化氫酶也普遍存在于植物的所有組織中，其活性與植物的代謝強度及抗寒、抗病能力有一定。本實驗通過對水稻萌發期活性測定以及對幼苗期過氧化氫酶活性的測定，學習和掌握和過氧化氫酶的測定方法，了解水稻生長與之代謝的關系。

Ⅰ 活性的測定
一、原理
能將淀粉水解成麥芽糖，由于麥芽糖能將3，5-二硝基水楊酸試劑還原成3-氨基-5-硝基水楊酸的橙紅色化合物，且在一定范圍內還原糖的濃度與反應液的顏色成正比，故利用比色法可求出麥芽糖的含量。以5分鐘內每克樣品水解產生麥芽糖的毫克數表示酶活性的大小。
植物可分為α-和β-兩種，其中β-不耐熱，在溫度70℃以上易鈍化：而α-不耐酸，在pH3.6以下則發生鈍化。根據以上特性，可分別測定這兩種的活性。如測定α-和β-的活性，即為總活性。
二、實驗材料、儀器及試劑
1．儀器：
20ml具塞試管 移液管 100ml容量瓶 石英砂 研缽
721型分光光度計 離心機 恒溫水箱 離心管
2．試劑：
（1）1%淀粉溶液：稱1.0克可溶性淀粉，加入100ml蒸餾水煮沸。（臨用時配制）
（2）pH5.6檸檬酸緩沖液：A、稱取檸檬酸21.0克，溶解后定容至1000ml；B、稱取檸檬酸鈉29.4克，溶解后定容至1000ml；量取A液55ml與B液145ml混勻，即為pH5.6的緩沖液。
（3）0.4mol/L氫氧化鈉溶液。
（4）3,5-二硝基水楊酸試劑：取1.0克3,5-二硝基水楊酸，溶于20ml mol/L氫氧化鈉中，加入50ml蒸餾水，再加入30克酒石酸鉀鈉，待溶解后，用蒸餾水稀釋至100ml，蓋緊瓶蓋，勿使二氧化碳進入。
（5）麥芽糖標準溶液：稱取0.1000克麥芽糖，溶于少量蒸餾水中，然后定容至100ml，取為1mg/ml麥芽糖標準液。實驗材料：萌發水稻種子。
三、實驗方法
1．酶液的制備：稱取去根萌發水稻種子2克（含外殼），置研缽中，加1克石英沙研磨成勻漿。用8ml蒸餾水分次洗滌研缽，將勻漿轉入離心管中，攪拌均勻后放置15～20分鐘（間隔攪拌2～3次）。3500rpm離心10分鐘，將上清液轉入100ml容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，得粗酶液。
2．α與β-的酶促反應：
取4支10ml具塞刻度試管，編號，按下表加入各液：
水稻萌發及幼苗期和過氧化氫酶活性測定
將以上各管混勻后，置40℃水浴準確保溫5分鐘，取出后立即向3、4號試管中加入4ml 0.4mol/L NaOH終止酶活性。
3．麥芽糖的測定：
（1）標準曲線制作：取20ml 刻度試管7 支，編號，分別加入1mg/ml 麥芽糖標準液0，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.0ml，然后各管加蒸餾水，使體積均達2ml，再向各管加3，5-二硝基水楊酸試劑2ml，置沸水浴中煮沸5分鐘，取出后冷卻，用蒸餾水稀釋至20ml，搖勻后在520nm波長下用分光光度計比色，以光密度值為縱坐標，麥芽糖含量為橫坐標繪制標準曲線。
（2）樣品的測定：取以上酶作用后的反應液及對照管中的溶液各2ml，分別放入20ml具塞刻度試管中，加入2ml3，5-二硝基水楊酸試劑，置沸水浴中準確煮沸5分鐘，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至20ml，搖勻在520nm波長下用分光光度計比色，記錄OD值，從麥芽糖曲線中查出相應麥芽糖含量，進行結果計算。
四、結果計算
水稻萌發及幼苗期和過氧化氫酶活性測定
A—為酶反應管中麥芽糖含量，即3，4號管中麥芽糖毫克數的平均值。
A′—為對照管中麥芽糖含量，即1，2號管中麥芽糖毫克數的平均值。