士鋒RNA的電泳，轉膜和雜交

實驗原理：基本同Southern Blotting，但因RNA是單鏈分子，必須消除局部區域形成的二級結構，在電場中泳動的距離才能反映它本身的大小，因而需使用變性膠進行電泳；操作過程中應特別注意防止RNA的降解。 
實驗材料：經檢測質量好的RNA樣品 
實驗步驟： 
1.制膠： 
Agarose 1%-1.2%，1×MOPS buffer。 
用滅菌的DEPC水定容，加熱融化，冷卻至70℃加甲醛，使終濃度為2%，通風櫥中放1hr。 
2.準備電泳液：1×MOPS buffer（小號槽約配500ml，中號槽約配900ml） 
3.制樣：測好濃度后按以下體系加樣 
15 mg RNA + 滅菌的DEPC水 10 ml 
Sample buffer 8 ml 
loADIng buffer 2 ml 
EB (10mg/ml,于RNA) 0.03 ml 
65℃水浴變性10 min，立即放冰上，直至點樣 
4.點樣：點樣要仔細，不要漏出，并記錄點樣順序。 
5.電泳：中號槽: 電壓100V電泳1hr左右，至溴酚蘭離點樣孔約3.5-4cm（凝膠在紫外燈下可看到28S和18S剛好分開即可） 
6.轉膜：轉膜液用500ml 4×SSC加27ml 37%甲醛（終濃度為2%）；轉膜步驟同Southern。注意加溶液后一切操作均在通風櫥內進行，以避免甲醛對人體的傷害 
7.照相：將膠及膜取下，分別在凝膠成像系統下看膠上RNA是否有殘留，膜上RNA效果是否完好。 
8.風干：在超凈工作臺上吹干。 
9.固定：于紫外交聯儀內以1200 ENERGY照一次約半分鐘，再重復一次，再在超凈工作臺上吹干。 
10.雜交：在雜交管內加約50ml雜交液，將膜卷起放入，注意RNA面朝內,于64℃預雜交1-4hr 
11.探針準備：預先挖膠回收的PCR產物或酶切產物（better），測濃度，跑膠驗證后，按以下體系加入 
DNA 3 ml（約200ng） 
ddH2O 10 ml 
DNTP（1.67mM） 4 ml 
雜交Buffer 10 ml 
Klenow Fragment 2 ml 
α-dCTP* 5 ml 
先加入DNA 和 ddH2O,100℃變性10min，冰上放5min，再加入DNTP和雜交 primer，加酶時注意低溫操作，先加在管壁上，立即到同位素室加同位素，混勻離心，于室溫下反應半小時。 
12.探針純化：在原反應體系中繼續加入 
ddH2O 66 ml 
NaAc 10 ml 
無水乙醇 250 ml 
混勻離心12000rpm 5min，倒去上清后加500 ml無水乙醇洗,離心 2 min，12000 rpm，倒去上清，檢測信號，達103-104較好，加40 ml ddH2O和400 ml雜交液之后混勻離心，于100℃變性10min，冰上放置5min 
13.13探針：取出雜交管倒去雜交液，加入15ml雜交液，將探針加入,蓋緊，于64℃雜交過夜 
14.洗膜，壓片：將雜交管中液體倒出，先加少量洗膜液Ⅰ，冷洗5min，倒出，再多加些洗膜液Ⅰ，冷洗10min，將膜取出測信號，根據信號大小決定是否熱洗，若信號高，用洗膜液Ⅱ，Ⅲ繼續洗，直到信號值達到適宜值為止，即膜上某一區域信號強，而其他區域信號弱代表雜交上了，然后包膜壓片，放于-20℃或-80℃3天左右即可洗X片。 
15.結果觀察與分析