士鋒生物酶聯免疫吸附試驗測定傷寒桿菌“O”抗體實驗步驟和技巧

酶聯免疫吸附試驗是用酶標記的抗體(或SPA)檢測未知抗原或抗體的方法。此法敏感性高，特異性強。常用的是ELISA方法，間接法，雙抗體法和抗原法。本次試驗介紹，酶聯葡萄球菌蛋白A免疫分析法。ELISA法原理如下，見圖9
1.加抗原使之吸附于固相載體(如塑料反應板)
2.洗滌加待測血清
3.洗滌加酶標記SpA
4.洗滌加酶的底物。經酶的催化產生有色產物。<img alt="酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定傷寒桿菌“O”抗體" 酶聯免疫吸附試驗（elisa）測定傷寒桿菌“o”抗體"="" border="1" height="264" data-cke-saved-src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120516/1350515c2-0.jpg" src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120516/1350515c2-0.jpg" width="372" style="vertical-align: middle; border: 0px; font-family: helvetica, tahoma, arial, 宋體, sans-serif; font-size: 14px; line-height: 21px; text-align: -webkit-center;">材料：
1.聚乙烯塑料反應板(PH9.6時可吸附蛋白Ag)
2.抗原：傷寒桿菌O901煮沸或超聲波粉碎抗原
3.待測血清
4.凍干酶聯葡萄球菌A蛋白(HRD—proteinA)純品
5.鄰苯二胺(OPD)
6.包被液：0.05M碳酸鈉—溶液PH9.6
7.稀釋液：10%免疫血清PBS—吐溫20，防止非特異性吸附
8.洗滌液：0.02MTrisTWeen20,Ph7.4防止非特異性吸附
9.底物溶液：0.02M25.7毫升
0.1M檸檬酸24.3毫升
蒸餾水50毫升
臨用前新鮮配制，在上述緩沖液中溶解40毫克鄰苯二胺，然后加入30%雙氧水0.15毫升，底物對光敏感，需要避光并立即使用。
10.終止液;2M硫酸
方法：
1.抗原包被
取潔凈的聚苯乙烯微量反應板，于每孔內加傷寒抗原0.1毫升(用包被緩沖液稀釋，蛋白含量10微克/毫升)，置37℃1小時，棄抗原液，用洗滌液3次每次3分鐘。
2.加待測血清
于每孔內分別加不同稀釋度(如1：5，1：10，1：20…1：80)的待測血清，PBS空白對照，陰性對照血清，陽性對照血清各0.1毫升。置37℃30分鐘，洗滌3次。
3.加酶聯A蛋白
于每孔加酶聯A蛋白各0.1毫升，置37℃20分鐘，洗滌3次。
4.加臨時配制的底物溶液各0.1毫升，置暗處15分鐘。加2M碳酸1滴終止反應。
5.結果判斷：(肉眼判斷)
若顏色于陰性對照相同則為陰性，若較陰性對照深則為陽性，根據顏色深淺以(+)表示。