士鋒生物細胞的選擇

（一）脾細胞 
1．材料 
(1) 免疫過的血清抗體滴度高的Balb/c鼠。 
(2) 1640培養液 
(3) 2.5％FCS－1640營養液 
2．操作方法 
(1) 拉頸或用CO2處死小白鼠。 
(2) 將小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在無菌條件下取脾。 
(3) 把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。 
(4) 用鑷子輕輕擠壓脾，做成脾細胞懸液，用毛細管將懸液移入小試管中。 
(5) 直立小試管3min，使大塊的結締組織下沉，把細胞懸液移入離心管中。 
(6) 以2.5％FCS—1640充滿離心管，并以400g離心7min～10min（與此同時應開始制備骨髓細胞）。 
(7) 把沉淀用約10ml的新鮮培養液再懸浮。 
(8) 重復⑹、⑺步驟。 
(9) 計算細胞，以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細胞數應高于80％為合格。 
（二）骨髓瘤細胞 
骨髓瘤細胞能產生并分泌大量的免疫球蛋白，這樣的瘤細胞融合后，可能影響或降低所分泌抗體的滴度，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細胞。 
選擇骨髓瘤細胞的條件：①該瘤細胞系的來源應與制備脾細胞小鼠為同一品系，以便兩者的組織相容性抗原一致；②骨髓瘤細胞必須是靜息狀態，不產生γ球蛋白或不分泌到細胞外；③骨髓瘤細胞生長需要一個較高的細胞密度,106個細胞/ml；④生長速度快，繁殖時間短。 
目前常用的Balb/c小鼠產生的骨髓瘤細胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（簡稱SP2）；③P2—X？ -—Ag8·6·5·3（簡稱653）；④FO 
以653zui為常用，它是由礦物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）誘發出來的一種漿細胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并經過培育形成一株8-氮有抵抗力的亞系。 
骨髓瘤細胞一般由有關單位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，試驗時復蘇、增殖、傳代即可。 
由于骨髓瘤細胞是半貼壁狀態，很容易脫落，因此不需要處理。為了防止出現返祖現象，在融合前，可將培養基內加入15μg/ml 8－氮。取約1×107～6×107對數生（即培養15h～20h）的骨髓瘤細胞，在室溫離心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再懸浮并計數。 
（三）飼養細胞 
在體外的細胞培養中，單個的或數量很少的細胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細胞才能使其生長繁殖，加入的細胞稱之為飼養細胞（Feeder cell）。在細胞融合和單克隆的選擇過程中，就是在少量的或單個細胞的基礎上使其生長繁殖成群體，因此在這一過程中必須使用飼養細胞。許多種類的動物細胞都可以做飼養細胞，如正常的脾細胞、胸腺細胞、腹腔滲出細胞等，常選用腹腔滲出細胞，其中主要是巨噬細胞和淋巴細胞。應用腹腔滲出細胞的好處是：一方面做飼養細胞，另一方面巨噬細胞可以吞噬死亡的細胞和細胞碎片，為融合細胞的生長造成良好的環境。腹腔細胞的來源可以是與骨髓瘤細胞同系鼠。也可以是其他種類的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。 
1．材料 
（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。 
（2）11.6％蔗糖溶液（經10磅30min高壓滅菌）。 
2．操作方法 
（1）拉頸處死小鼠。 
（2）70％酒精浸泡消毒10min。 
（3）用將小鼠腹部剪開一小口，剝開皮膚，露出腹腔。 
（4）用注射器將4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體，加入離心管。 
（5）1 000r／min離心10min。 
（6）取上清，以HAT選擇培養液將細胞制成懸液。臺盼藍染色計數活細胞，使每毫升含40萬個活細胞。 
（7）以1ml吸管將細胞種入微量培養皿，每孔0.05ml，含2萬個細胞，放入CO2培養箱培養，即可供細胞融合和克隆化之用。如果在融合后發現在培養孔中飼養細胞數量少，則可以在細胞換液時再加入一些。