利用克隆化的真核基因在哺乳動物細胞中表達蛋白質(zhì)，具有以下多種不同用途：
（1）通過對所編碼的蛋白質(zhì)進行免疫學檢測或生物活性測定，確證所克隆的基因。
（2）對所編碼的蛋白質(zhì)須進行糖基化或蛋白酶水解等翻譯后加工的基因進行表達。
（3）大量生產(chǎn)從自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。
（4）研究在各種不同類型細胞中表達的蛋白質(zhì)的生物合成以及在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的情況。
（5）通過分析正常蛋白質(zhì)及其突變體的特性，闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。
（6）使帶有內(nèi)含子而不能在原核生物如酵母中正確轉(zhuǎn)錄為 mRNA的基因組序列得到表達。
（7）揭示某些與基因表達調(diào)控有關(guān)的DNA序列元件。
DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)現(xiàn)已變成研究基因功能和組分的重要工具，已發(fā)展了很多轉(zhuǎn)染方法，并成功應用于轉(zhuǎn)染各種細胞。目前廣泛應用方法有磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、病毒載體，以及陽離子脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染法。
進行真核轉(zhuǎn)染的一般程序：
克隆目的基因（經(jīng)測序驗證）-準備真核表達載體-將目的基因插入表達載體中-轉(zhuǎn)染-篩選-鑒定下面以pcDNA3為載體，p16為目的基因，介紹真核轉(zhuǎn)染的實驗操作。
一、試劑準備
1、HBS（Hepes-buffered saline）：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,調(diào)pH到7.4,補ddH2O至100ml,pH7.4，濾過除菌。
2、核酸貯存液，過濾除菌。
3、培養(yǎng)基：含血清或不含血清的，用于轉(zhuǎn)染細胞的正常培養(yǎng)。
二、操作步驟
（一）克隆目的基因
1、根據(jù)GenBank檢索的目的基因序列，設計擴增引物，并在上、下游引物的5’-端分別引入酶切位點BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。
2、回收特異性擴增片段，連入T載體。
3、轉(zhuǎn)化DH5α，質(zhì)粒制備。
4、酶切初步鑒定，測序證實。
（二）真核重組表達載體的構(gòu)建：
pcDNA3載體帶有在大腸桿菌中復制的原核序列、便于挑選帶重組質(zhì)粒細菌的抗生素抗性基因，以及表達外源DNA序列所必需的所有真核表達組件。
重組質(zhì)粒與pcDNA3分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切回收插入片段和pcDNA3線性片段
T4連接酶連接
轉(zhuǎn)化DH5α
質(zhì)粒制備
BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。
（三）重組pcDNA3轉(zhuǎn)染SHG-44細胞：
1、G418篩選濃度測定：SHG-44培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板→G418 分別用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各濃度3復孔，設正常對照3復孔。以10-14天細胞全部死亡的濃度為篩選濃度，結(jié)果為200mg/L。
2、在轉(zhuǎn)染實驗前天接種細胞，各種細胞的平板密度依據(jù)各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉(zhuǎn)染當天細胞應達到60%-80%覆蓋。一般要求，6孔培養(yǎng)皿（35mm），每孔1-2ml培養(yǎng)基3×105細胞。依據(jù)不同大小培養(yǎng)板調(diào)整每平方厘米的細胞數(shù)量。
典型貼壁細胞平板密度
培養(yǎng)板大小 生長面積（cm2）大約細胞數(shù) 培養(yǎng)基容積（ml）
組織培養(yǎng)皿
（φ60mm）
28 6.6×105 5-6
6孔培養(yǎng)板
（φ35mm）
9.5 3×105 1-2
12孔培養(yǎng)板
φ22.6mm）
4 1.3×105 0.5-1
24孔培養(yǎng)板
（φ8mm）
0.5 0.6×105 0.25-0.5
3、SHG-44細胞的轉(zhuǎn)染：
（1）轉(zhuǎn)染當天，加入脂質(zhì)體/ DNA混合物之前的短時間內(nèi)，更換1ml新鮮的有血清或無血清培養(yǎng)基。
（2）準備不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以確定每個細胞系的*比例。① 溶液A：用HBS稀釋DNA（pcDNA3、重組pcDNA3）各1.5μg 到總體積50μl（30μg/ml）。②溶液B：用HBS稀釋6μl脂質(zhì)體到終容積50μl（120μg/ml）。③混合溶液A和B，輕柔混合（不要振蕩），室溫孵育15min，以便脂質(zhì)體/DNA混合物形成。
（3）不要移去培養(yǎng)基，逐滴加入100μl 脂質(zhì)體/DNA混合物（從培養(yǎng)孔一邊到另一邊），邊加邊輕搖培養(yǎng)板。
（4）37℃孵育6hr。
（5）6hr后更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入2-3ml新鮮生長培養(yǎng)基。
（6）轉(zhuǎn)染24hr后施加篩選壓力，改用含G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)。
4、G418篩選：在G418篩選濃度下持續(xù)培養(yǎng)14天后，挑出單克隆，擴大培養(yǎng)，同時轉(zhuǎn)染pcDNA3即SHG-44-vect，并設對照組細胞即SHG-44。
（一）篩選結(jié)果鑒定：
（1）基因組DNA提取→PCR鑒定外源基因
（2）SHG-44-重組pcDNA3陽性細胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝膠電泳→免疫印跡鑒定P16蛋白表達（Westernblot）。
（3）測定外源性基因?qū)HG-44細胞增殖的影響
①流式細胞儀分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→單細胞懸液→70%酒精固定→裂解細胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上機分析G1期和G2/M、S期比例。
②細胞生長曲線測定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→5×104/孔接種24孔培養(yǎng)板→24hr后各自用苔盼藍染色計數(shù)細胞→計算細胞生長抑制百分率。
③軟瓊脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→104 細胞→0.3%低熔點瓊脂糖培養(yǎng)→1-2周后計數(shù)不可少于50個細胞的克隆數(shù)→計算克隆形成率抑制率。
三、注意事項
1、優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件（脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時間）每種細胞和質(zhì)粒均須進行。用于轉(zhuǎn)染的核酸應高度純化。為避免微生物污染，所用溶液濾過滅菌，以及隨后的使用應在無菌條件下，這是細胞慣常的做法。但是，脂質(zhì)體以及脂質(zhì)體/ DNA混合物無需濾過除菌。
2、預備脂質(zhì)體/DNA混合物必須在無血清下進行。但是在隨后的脂質(zhì)體/ DNA與被轉(zhuǎn)染細胞共孵育的過程中，血清又是培養(yǎng)基的一部分。
3、在轉(zhuǎn)染之前更換培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)染效率，但所用培養(yǎng)基必須37℃預溫。脂質(zhì)體/ DNA混合物應當逐滴加入，盡可能保持一致，從培養(yǎng)皿一邊到另一邊，邊加入邊輕搖培養(yǎng)皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。
