小鼠胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基的配制：

實(shí)驗(yàn)步驟：在超凈臺(tái)內(nèi)，安裝好濾器。

用去離子水溶解1640培養(yǎng)基，并用磁力攪拌器攪拌2 h，使之充分溶解。

在超凈臺(tái)內(nèi)過(guò)濾。

分裝到250 mL的玻璃瓶?jī)?nèi)。

用封口膜封好，-20℃保存，過(guò)濾結(jié)束時(shí)，還要取少許培養(yǎng)基進(jìn)行菌培，驗(yàn)證培養(yǎng)基是否是無(wú)菌。

胎牛血清的處理：

沒(méi)有滅活的血清中含有補(bǔ)體成分，需要將血清在56℃條件下滅活30 min。在水浴鍋內(nèi)進(jìn)行，滅活的過(guò)程中，要不停地?fù)u晃，使受熱均勻，防止沉淀析出來(lái)。

注意：

剛?cè)〕龅膬龃嫜宀灰⒓捶湃?6℃中，因?yàn)橥蝗坏臏囟壬邥?huì)使裝血清的玻璃瓶破裂，應(yīng)該放在室溫逐漸溶解，然后，再進(jìn)行滅活處理。

生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制：

90 mL IMDM中加入大約10 mL的胎牛血清（10% 左右），雙抗可以不加。

（有資料表明雙抗對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用）Hanks 和D-Hanks液，以及*的配制Hanks液是一種常用的*，D-hanks液是不含鈣鎂的Hanks液。它們與細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況下的pH值和滲透壓一致，細(xì)胞在Hanks液中可生存幾個(gè)小時(shí)，Hanks液主要用于清洗細(xì)胞。

D-Hanks液主要用于配制*。配制Hanks液需將CaCl2溶于蒸餾水，再將其它試劑配制成溶液，將兩次配制的溶液混合，定容。*是一種常用的細(xì)胞消化液，在原代培養(yǎng)時(shí)，用*消化，使細(xì)胞從組織塊中游離出來(lái)。

傳代培養(yǎng)時(shí)，用*消化貼壁的細(xì)胞，并分散成單個(gè)細(xì)胞。

*分離細(xì)胞的能力與不僅與*作用的溫度、時(shí)間、濃度和pH有關(guān)，還與細(xì)胞的類(lèi)型和特性有關(guān)。

用于原代培養(yǎng)消化組織塊采用的濃度為：0.1% 或 0.125%；

用于傳代培養(yǎng)采用的*濃度為：0.25%或者0.2%。

*的配制：

1）由于*的作用主要機(jī)制是通過(guò)螯合鈣鎂離子，而鈣鎂離子是保持細(xì)胞和細(xì)胞之間相互連接所必需的，所以，*的配制用無(wú)鈣鎂的D-Hank液，避免鈣鎂離子干擾*的活性。

2）*在pH8.0時(shí)活性zui強(qiáng)，在過(guò)濾除菌前，須用NaHCO3干粉調(diào)溶液的pH值。

3）*受熱容易分解，所以避免盛夏配制，在配制過(guò)程中，溫度保持在4℃，zui后-20℃凍存。反復(fù)凍溶會(huì)影響*的活性，要分裝凍存。

4）血清能降低*的活性，所以，在終止*的消化反應(yīng)時(shí)，可加入含有血清的培養(yǎng)基。

[實(shí)驗(yàn)步驟]

配制Hanks液，高壓滅菌，4℃保存。稱取*，在冰浴上進(jìn)行研磨，并加入少量的D-Hanks液，使其呈糊狀，zui后用D-Hanks定容，過(guò)濾除菌。

分裝后，-20℃保存。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)步驟]

1、準(zhǔn)備工作：

1）肥皂洗手，在進(jìn)行無(wú)菌操作前，用75% 的酒精擦拭雙手，注意指間，和指甲周?chē)Ｍ瑫r(shí)，用酒精棉球擦拭超凈臺(tái)。

2）將培養(yǎng)液放置室溫，備用。

3）打開(kāi)超凈臺(tái)內(nèi)的紫外燈，照射20 min。同時(shí)，將實(shí)驗(yàn)所需材料也放入超凈臺(tái)進(jìn)行滅菌（血清、培養(yǎng)基除外）

4）倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞的狀態(tài)，是否已經(jīng)長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，需要進(jìn)行分瓶。

2、關(guān)閉超凈臺(tái)的紫外燈，打開(kāi)風(fēng)機(jī)。

3、點(diǎn)燃酒精燈，取出刻度吸管，在火焰上略燒，然后，安上吸球待用。

4、在打開(kāi)培養(yǎng)瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶蓋，打開(kāi)后，瓶口在酒精燈上過(guò)火焰，再用吸管輕輕吸出舊的培養(yǎng)液，注意，吸管不要碰到布滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶的側(cè)壁。

5、將*加入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),顯微鏡下隨時(shí)觀察，見(jiàn)到細(xì)胞的突起消失，變圓時(shí)，立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸出*。記住不要消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則，細(xì)胞會(huì)被*消化掉。

6、加入適量Hanks液或培養(yǎng)基清洗一遍，立即倒掉。

7、加入含有10%血清的培養(yǎng)基，用吹打管吹打，一定要輕輕吹打，使其從瓶壁上脫落分散到培養(yǎng)基中，再補(bǔ)加培養(yǎng)基，按1:3進(jìn)行分瓶。

然后，用火焰燒培養(yǎng)瓶的瓶口和蓋，再蓋好培養(yǎng)瓶的蓋，放到培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

以上介紹的是貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法，對(duì)于懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法，只需要將細(xì)胞進(jìn)行離心，1000 rpm，5 min,然后，換入新的培養(yǎng)基即可。

再分裝到不同的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

不健康的細(xì)胞質(zhì)中有空泡，細(xì)胞內(nèi)有顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞間空隙增大，變形，不規(guī)則，失去原有的特點(diǎn)。

是否污染：

傳代或換液24~ 48 h注意觀察細(xì)胞是否被污染，污染的細(xì)胞培養(yǎng)液變渾濁，鏡下可見(jiàn)有大量菌絲。如果細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)特性改變，胞質(zhì)內(nèi)顆粒性物質(zhì)增多，盡管培養(yǎng)液不變渾濁，考慮可能有支原體污染。污染的細(xì)胞立即從培養(yǎng)箱中取走，以免污染其它細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)四、

細(xì)胞凍存與復(fù)蘇[實(shí)驗(yàn)步驟]

1. 為了保證細(xì)胞良好的狀態(tài)，在細(xì)胞凍存的前一天使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，同時(shí)將細(xì)胞換液，次日，按照細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法，用*消化貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞用培養(yǎng)基沖下來(lái)，然后，用50 mL尖底離心管離心，1000 rpm，4min，棄上清，收集細(xì)胞。

2. 加入適量的凍存液（10% DMSO 和 90%含有20%血清的IMDM培養(yǎng)基）

3. 分裝到凍存管中，做好標(biāo)記，標(biāo)明細(xì)胞名稱，保存時(shí)間，所用培養(yǎng)基等。

4. 4℃放置30 min；-20℃放置1.5 h； -70℃放置12 h；zui后移到液氮罐中。

  小鼠胚胎成纖維細(xì)胞

細(xì)胞的復(fù)蘇：細(xì)胞的復(fù)蘇原則是快速溶化，因?yàn)槿绻徛娜芑瑫?huì)使進(jìn)入細(xì)胞的水分形成冰晶，對(duì)細(xì)胞造成傷害，因此，在復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，將凍存細(xì)胞直接放到37℃的水浴中，使其迅速溶解。在超凈臺(tái)內(nèi)將凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸浮液直接倒入小培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)，然后，加入3 mL的培養(yǎng)液。次日，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并更換細(xì)胞培養(yǎng)液。