簡介

　　古語說：“工欲善其事，必先利其器”。要想很好地應(yīng)用流式細(xì)胞分析和分選技術(shù)，必需先對儀器進(jìn)行調(diào)試，使其處于良好的工作狀態(tài)，并能正確使用儀器。下面簡要介紹細(xì)胞計(jì)的調(diào)試項(xiàng)目及要點(diǎn)、使用的程序等等。

　　調(diào)試和校準(zhǔn)

　　流式細(xì)胞儀在使用前，甚至在使用過程中都要精心進(jìn)行調(diào)試，以保證工作的可靠性。調(diào)試的項(xiàng)目主要是激光強(qiáng)度、液流速度和測量區(qū)的光路等。

　　激光強(qiáng)度：除調(diào)整反射鏡的角度以調(diào)整到所需波長的激光出光外，還要結(jié)合顯示屏上的光譜曲線使激光的強(qiáng)度輸出為大。

　　液流速度：可通過操作臺數(shù)字顯示監(jiān)督，調(diào)節(jié)　氣體壓力大小以獲得穩(wěn)定的液流速度。

　　測量區(qū)光路調(diào)節(jié)　：這是調(diào)試工作的關(guān)鍵。需要保證在測量區(qū)的液流、激光束、90散射測量光電系統(tǒng)垂直正交，而且交點(diǎn)較小。一般可在用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球等校準(zhǔn)中完成。

　　流式細(xì)胞術(shù)中所測得的量是相對值，因此需要在使用前或使用中對系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)或標(biāo)定，這樣才能通過相對測量獲得的意義。因而FCM中的校準(zhǔn)具有雙重功能：儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度。標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)該穩(wěn)定，有形成份形狀應(yīng)是大小比較一致球形，樣品分散性能良好，且經(jīng)濟(jì)、容易獲得。常用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品，雞血紅細(xì)胞做為生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品。微球用樹脂材料制作，或標(biāo)有熒光素，或不標(biāo)記熒光素。所用的雞血紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品制作過程昭下：取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血(抗凝劑：雞血=1：4)，經(jīng)PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細(xì)胞混合，室溫下振蕩醛化24h，后經(jīng)PBS再清洗，貯4℃冰箱中備用。需要指出的是因?yàn)槲唇?jīng)熒光染色，所測光信號為雞血紅蛋白的自發(fā)熒光。

　　儀器的操作和使用

　　①打開電源，對系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)熱；

　　②打開氣體閾，調(diào)節(jié)　壓力，獲得適宜的液流速度；開啟光源冷卻系統(tǒng)；

　　③在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)；

　　④利用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上，0和90散射的熒光強(qiáng)度，并要求變異系數(shù)為小；

　　⑤選定流速、測量細(xì)胞數(shù)、測量參數(shù)等，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品；同時(shí)選擇計(jì)算機(jī)屏上數(shù)據(jù)的顯示方式，從而能直觀掌握測量進(jìn)程；

　　⑥樣品測量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)；

　　⑦因?yàn)閷?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已存入計(jì)算機(jī)硬盤(有的機(jī)器還備有光盤系統(tǒng)，存貯量更大)，因此可關(guān)閉氣體、測量裝置，而單獨(dú)使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；

　　⑧將所需結(jié)果打印出來。

　　操作和使用中的注意事項(xiàng)

　　1)光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件，暴露的較強(qiáng)的光線下以后，需要較長時(shí)間的“暗適應(yīng)”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽；

　　2)光源不得在短時(shí)間內(nèi)(一般要1h左右)關(guān)上又打開；使用光源必須預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常；

　　3)液流系統(tǒng)必需隨時(shí)保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要經(jīng)過過濾、消毒；

　　4)注意根據(jù)測量對象的變換選用合適的濾片系統(tǒng)、放大器的類型等；

　　5)特別強(qiáng)調(diào)每次測量都需要對照組。